基于斑马鱼生物模型评价青钱柳叶水提物的降糖作用

刘均 ，李强 ，谭蓉 *

（1.中华全国供销合作总社杭州茶叶研究院，浙江杭州 310016；2.浙江省茶资源跨界应用技术重点实验室，浙江杭州 310016）

青钱柳（Cyclocarya paliurus，CP）属于胡桃科青钱柳属植物，是古老珍稀树种，仅存于中国。卫健委2013 年第10 号公告将CP 叶纳入新食品原料管理， 标志着其可以直接应用于食品或功能食品中。 目前，市场上以CP 单品或者与其它相近功能的原料复配开发的功能产品琳琅满目， 种类繁多。但其在产业化应用方面， 主要存在两点限制性因素，一是CP 叶水浸出物药味浓郁、甜味过重影响口感；二是产品实际功效尚缺乏现代科学实验技术论证分析。 因此，研究主要针对第二方面限制性因素，采用新构建的糖代谢异常斑马鱼（Zebrafish）模型对CP 叶水全浸出物进行降糖作用评估，也为降糖药物的筛选和降糖组方开发提供新的策略。

斑马鱼是一种脊椎模式生物， 与人类基因具有高度相似性，已成为生命科学研究的新宠。利用斑马鱼构建人类疾病模型，如糖尿病[1-2]、高血脂[3-4]、高尿酸症[5-6]、失眠[7-8]等可以有效开展靶向药物筛选以及药物安全与毒理评价研究。 斑马鱼具有个体小、发育周期短、实验周期短、费用低、单次产卵数较高、 实验用药量小等显著优势可以有效缩短实验周期和节约试验成本。 斑马鱼实验属于在体研究，可以作为连接非脊椎动物（细胞等）和哺乳动物（大小鼠等）实验之间的生物学断层，完善现有药物研发体系。糖尿病是一种世界性疾病，目前尚无有效的治愈措施， 长期的高血糖状态容易引起机体的糖耐量受损、胰岛素敏感性降低，以及诱发诸如肝脏、肾脏等多种重要脏器衰竭，对健康威胁甚巨。因此，构建适用性和实用性强的糖尿病病理模型是十分重要的。 斑马鱼是一种新兴的模型生物，使用其开展在体药物安全性和功能性研究，可以加快糖尿病治疗药物筛选或研发。

目前在糖尿病建模方面， 主要是以斑马鱼成鱼为主， 采用的造模方式与大小鼠糖尿病造模方式相近，方法主要为：腹腔注射特定剂量的四氧嘧啶（Alloxan，ALX）或链脲佐菌素[9-10]溶液；ALX 溶液与葡萄糖（glucose，GLU）溶液联用诱导建模[11]；采用过度饲喂法建立胰岛素抵抗型糖尿病[12]。SHIN 等[11]研究发现采用 300 mg/100 mL ALX 溶液诱导30 min， 再用 1% GLU 溶液孵育 30 min，最后在水溶液中孵育1 h 可以诱导建立斑马鱼高血糖模型。ZANG 等[12]采用每天喂食6 次的过度喂养法进行建模，斑马鱼空腹血糖水平显著增加，可以有效建立2 型糖尿病模型。 劳乔聪[13]以4 dpf（days post fertilization）斑马鱼为对象，联用40 mg/mL 蔗糖与1 mM ALX 可以有效建立糖尿病模型。目前以斑马鱼幼鱼为对象， 开展糖尿病斑马鱼生物模型建设的研究报道还较为鲜见。 研究以5 dpf斑马鱼为对象， 采用GLU 单独或与ALX 诱导药物联合探讨建立基于生理和病理生理的糖代谢异常斑马鱼模型，并同时结合模型开展了CP 叶全水浸物的降糖作用评估， 为功能性代茶饮开发提供参考和借鉴。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料制备及试剂

50 mg/mL CP（文成县泉山中药材种植有限公司）储备液制备：称取5 g CP 于烧杯中，在80 ℃恒温水浴锅中浸提3 次，每次浸提30 min，合并滤液定容至100 mL， 保存于4 ℃冷藏备用。 50 mg/mL 阿卡波糖（Acarbose，ACA，拜耳医药保健有限公司）贮备液制备：称取5 g ACA 于烧杯中，加入蒸馏水搅拌溶解过滤后定容至100 mL， 保存于4℃冷藏备用；ALX （CAS 号：2244-11-3， 纯度≥98.0%， 合肥博美生物科技有限责任公司）：144 μg/mL ALX 母液制备， 称量0.0144 g ALX 于烧杯中，加入蒸馏水搅拌溶解并定容于100 mL 容量瓶中， 冷藏备用。 GLU （国药集团化学试剂有限公司）；三卡因甲磺酸（CAS 号：886-86-2，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）； 磷酸缓冲盐溶液（pH7.02，南京建成生物工程研究所）；GLU 检测试剂盒 （葡萄糖氧化酶法， 南京建成生物工程研究所）。

1.1.2 试验仪器

酶标仪（Multiskan SkyHigh， 赛默飞世尔科技（中国）有限公司）；全自动智能型生化（霉菌）培养箱 （天津市宏诺仪器有限公司）； 精密电子天平（AL-204，梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司）；手持式高速匀浆机（MY-20，上海净信实业发展有限公司）；离心机（3K1S，德国sigma 离心机公司）；水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）。

1.1.3 试验动物

斑马鱼（3 月龄，AB 型，上海费曦生物科技有限公司）。 斑马鱼胚胎的繁殖以自然交配方式进行。 每个产卵盒中按1：1 放入公鱼和母鱼， 放入28.5 ℃恒温培养箱中。光周期设置为：14 h 光照与10 h 黑暗，于第二天上午收集胚胎，去除死卵和粪便， 清洗后换孵育水 （60 μg/mL 海盐水）， 置于28.5 ℃恒温培养箱中恒温孵育， 每24 h 换水一次，并去掉卵膜和死卵。 处理结束时，采用三卡因甲磺酸对斑马鱼进行麻醉处死。

1.2 实验方法

1.2.1 GLU 与ALX 联用建立糖尿病模型可行性及有效性研究

（1）联合建模可行性：基于前期研究基础[14]，将发育正常5 dpf 野生型AB 系斑马鱼随机分为4组，每组3 个重复，每个重复 15 条，分别给予 0 mg/mL GLU+0 mM ALX、22 mg/mL GLU+0 mM ALX、22 mg/mL GLU+0.02 mM ALX、22 mg/mL GLU+0.04 mM ALX 溶液， 分别记为 T0、T1、T2、T3，每个重复加药物 5 mL。 培养 24 h 后，每个重复取10 条鱼检测组织GLU 含量， 探究 GLU 与ALX 联合建立糖尿病斑马鱼模型的可行性。

（2）联合建模有效性：基于上述研究，将发育正常5 dpf 野生型 AB 系斑马鱼采用22 mg/mL GLU+0.02 mM ALX 药物联合孵育24 h 以建立糖尿病模型， 然后将其随机分成4 组， 每组3 个重复， 每个重复20 条， 分别给予22 mg/mL GLU+0 mM ACA、22 mg/mL GLU+250 μg/mL ACA、22 mg/mL GLU+500 μg/mL ACA、22 mg/mL GLU+750 μg/mL ACA 溶 液 ， 分 别 记 为 MC、T-ACA250、TACA500、T-ACA750，每个重复加药物 6 mL，同步设置正常斑马鱼采用0 mg/mL GLU+0 mM ACA 孵育48 h（期间孵育24 h 时换水一次）作为空白对照组BC。 培养24 h 后，每个重复取10 条鱼检测组织GLU 含量， 探究GLU 与ALX 联合建立糖尿病斑马鱼模型的有效性。

1.2.2 基于生理和病理生理的斑马鱼模型评估CP降糖作用

（1） 不同浓度CP 对高糖溶液诱导糖代谢异常斑马鱼糖代谢影响

将发育正常5 dpf 野生型AB 系斑马鱼随机分为5 组，每组3 个重复，每个重复15 条，分别给予 0 mg/mL GLU、22 mg/mL GLU、22 mg/mL GLU+250 μg/mL CP、22 mg/mL GLU+500 μg/mL CP、22 mg/mL GLU+750 μg/mL CP 溶液， 分别记为 C1、C2、T-CP250、T-CP500、T-CP750， 每个重复加药物 5 mL。 培养至24 h 后，每个重复取 10 条鱼测定GLU 含量，研究基于高糖诱导糖代谢异常斑马鱼模型评估CP 的控糖作用。

（2） 不同浓度CP 对糖尿病斑马鱼糖代谢影响

将发育正常5 dpf 野生型AB 系斑马鱼采用22 mg/mL GLU+0.02 mM ALX 联合孵育 24 h 以诱导糖尿病模型并随机分为2 组，每组3 个重复，每个重复20 条，分别给予22 mg/mL GLU、22 mg/mL GLU+250 μg/mL CP 联合孵育 24 h， 分别记为 PC和T250 组，每个重复加药物6 mL，同步设置正常斑马鱼采用0 mg/mL GLU 孵育48 h（期间孵育24 h 时换水一次）作为空白对照组CK。 结束后，每个重复取10 条鱼测定GLU 含量， 研究基于糖尿病糖斑马鱼模型评估CP 的降糖作用。

1.3 检测方法

GLU 含量检测按如下步骤进行：取100 μL 磷酸缓冲盐溶液于装鱼的1.5 mL 离心管中，采用高速手持式匀浆机匀浆1 min，直至鱼体组织裂解充分，然后于 4 ℃下以 2500 转/秒离心 10 min，结束后取上清样2.5 μL 采用 GLU 检测试剂盒（GLU氧化酶法）测定GLU 浓度，其测定程序和方法按照试剂盒说明书规定的步骤进行。

1.4 统计分析

所有试验数据经Excel 2016 初步处理后，用Graphpad Prism 6.0 绘图，并用SPSS Statistics 17.0进行单因素方差分析（One-way ANOVA），所有数据均以平均值±标准差呈现， 差异显著性采用Duncan 分析并将进行多重比较，p＜0.05 表示组间差异显著。

2 结果与分析

2.1 GLU 与ALX 联合建立糖尿病斑马鱼模型可行性及有效性分析

从图 1a 中可以看出， 相较于 T0 组，T1 组斑马鱼 GLU 值增加了 6.80 倍（p＜0.05）；T2 和 T3 组斑马鱼 GLU 值分别增加了 7.52 倍 （p＜0.05）和9.15 倍（p＜0.05）。 与 T1 组相比，T2 和 T3 组斑马鱼 GLU 值分别增加了 9.24%（p＞0.05） 和 30.14%（p＞0.05）。 结果表明以 22 mg/mL GLU 与 0.02 和0.04 mM ALX 联用具有建立糖尿病斑马鱼的可行性。 从图1b 中可以看出，与T0 组相比，采用T1、T2 和T3 组斑马鱼平均体重都有一定程度的增加（p＞0.05）， 这可能与外源营养供给有关。 而与 T1组相比，T2 和T3 组斑马鱼平均体重有一定程度的下降（p＞0.05）。 综合图 1a 和 1b 结果表明，采用22 mg/mL GLU 与 0.02 和 0.04 mM ALX 联合建立的糖尿病斑马鱼的症状与糖尿病患者具有的 “高血糖、体重减轻”典型症状具有相似性[15]。 因孵育24 h， 时间周期较短， 较长孵育时间下的斑马鱼GLU 值和体重变化情况还有待进一步验证和研究。 图1c 反映的是孵育24 h 结束后，孵育液中的GLU 值变化情况。 从图 1c 中可以看出，T2 和 T3组孵育液中的GLU 值水平明显高于T1 组， 分别高出 8.65%（p＜0.05）和 5.13%（p＞0.05），表明采用22 mg/mL GLU 与 0.02 和 0.04 mM ALX 联合处理时从孵育液中吸收的GLU 含量有所降低。

综合图1 结果来看， 相较于高糖溶液诱导的生理模型，GLU 与ALX 联合建立的胰岛损伤型病理模型的斑马鱼从孵育液中吸收较少的GLU，体重减轻，但组织GLU 值却显著增加。 研究表明，胰岛损伤会造成胰岛素分泌不足， 进而影响体内GLU 的消耗供能[16-17]，机体能量供应不足后刺激机体产生更多的GLU[18-19]。因GLU 与ALX 联合造模组斑马鱼未从孵育液中吸收更多的GLU， 因而推测显著增加的GLU 推测可能来源于斑马鱼幼鱼体内卵黄囊的消耗供能有关， 这也与体重减轻症状相印证。

图1 葡萄糖与四氧嘧啶联合建立糖尿病模型的可行性分析Fig.1 Feasibility analysis of the combination of glucose and alloxan in the establishment of model of diabetes mellitus

从图2a 中可以看出，与BC 组相比，MC 斑马鱼 GLU 值显著增加，增长了 7.03 倍（p＜0.05），与前述研究具有一致性。 ACA 为常见糖尿病的治疗药物， 研究发现， 与 MC 组相比，T-ACA250、TACA500 和T-ACA750 组斑马鱼GLU 值显著降低（p＜0.05），分别降低了 55.10%、50.17%和 44.31%，表明以此方法建立的糖尿病斑马鱼是有效的。 图2b 和 c 显 示 ， 相 较 于 MC 组 ，T-ACA250、TACA500 和T-ACA750 组斑马鱼体重显著增加，250、500 和 750 μg/mL ACA 处理组分别增加了14.8%、25.91%和 25.91%，差异均显著（p＜0.05）。T-ACA250、T-ACA500 和 T-ACA750 组孵育液中的 GLU 水平均比 MC1 组低 （p＞0.05）， 表明采用ACA 治疗后斑马鱼从孵育液中吸收的能量物质有一定程度的增加。

综合图2 结果来看，相较于MC 组，采用ACA治疗后斑马鱼从孵育液中吸收的GLU 量增加，但斑马鱼组织GLU 值降低，这可能与糖尿病症状减轻、斑马鱼的GLU 利用率提高、体内合成代谢增强、使得斑马鱼平均体重增加有关。

图2 葡萄糖与四氧嘧啶联合建立糖尿病模型可行性有效性分析Fig.2 Effectiveness analysis of the combination of glucose and alloxan in the establishment of model of diabetes mellitus

2.2 CP 降糖作用分析

2.2.1 CP 对高糖溶液诱导糖代谢异常斑马鱼的降糖作用

基于以上研究发现采用22 mg/mL GLU 处理可以建立基于生理的糖代谢异常斑马鱼模型，并采用该模型对CP 的降糖作用进行研究。 图3a 显示，相比 C1 组，C2 组斑马鱼 GLU 值显著增加，增加了 2.98 倍（p＜0.05）。 相比 BC2 组，T-CP250、TCP500 和T-CP750 组斑马鱼GLU 值显著降低，分别降低了41.67%、48.33%和60.97%，差异均显著（p＜0.05），但 CP 治疗组间未出现显著性变化（p＞0.05）。 图 3b 和 c 显示， 相比 C2 组，T-CP250、TCP500 和T-CP750 组斑马鱼体重有一定程度的增加，分别增加了2.43%、2.43%和7.32%，差异均不显著（p＞0.05）；孵育液中 GLU 水平分别变化了-2.45%、-5.55%、3.10%，差异均不显著（p＞0.05）。综合图3，CP 除了具有降糖作用外，还对机体健康有益，有助于提高GLU 的利用效率。

图3 不同浓度青钱柳叶水提物对高糖溶液诱导斑马鱼组织葡萄糖值（a）、体重（b）和孵育液葡糖糖值（c）的影响Fig.3 Effects of different concentrations of the aqueous extract of Cyclocarya paliurus leaves on the level of glucose in tissue of zebrafish （a）， body weight （b） and the level of glucose （c） of culture medium induced by high glucose solution

2.2.2 CP 对糖尿病斑马鱼的降糖作用

采用基于病理的糖尿病斑马鱼模型进行低剂量浓度CP 对糖尿病的降糖效应研究。 从图4a 中可以看出， 与CK 组相比，PC 组显著增加斑马鱼GLU 值，增加了3.88 倍（p＜0.05）。 与 PC 组相比，T250 组斑马鱼GLU 值显著降低， 降低了29.97%（p＜0.05）。 图 4b 和 c 显示，PC 和T250 组斑马鱼体重均比 CK 组高 （p＞0.05）；T250 组比 PC 组高14.80%（p＞0.05）。 PC 和 T250 组间孵育液中 GLU水平变化较小，T250 组仅比 PC 组高 1.40%（p＞0.05）。 综合图4，结果表明CP 处理并未明显促进外源能量物质吸收， 但平均体重增加， 组织GLU值水平显著降低，表明CP 具有明显的降糖效应，并且可能具有改善机体健康，促进GLU 利用的作用，与增加斑马鱼体重的作用有关。因此基于病理生理的糖尿病斑马鱼模型的评价结果显示CP 具有明显的降糖效应， 其降糖机制可能与促进组织对GLU 的高效利用有关。

图4 青钱柳叶水提物对糖尿病斑马鱼组织葡萄糖值（a）、体重（b）和孵育液葡萄糖值（c）的影响Fig.4 Effects of the aqueous extract of Cyclocarya paliurus leaves on the level of glucose in the tissue of zebrafish（a）， body weight （b） and the level of glucose （c） in culture medium of diabetic zebrafish

3 讨论

目前研究中构建的糖尿病斑马鱼模型以成鱼为主， 采用斑马鱼幼鱼建模的研究目前还比较鲜见。但相比于使用斑马鱼成鱼建模来说，采用幼鱼建模操作更为简便，采用多孔板操作试验方便，样本量大 （每组45~60 条鱼）， 试验周期短 （24~48 h）。 显然以斑马鱼幼鱼构建糖尿病斑马鱼高通量药物筛选模型更具有明显的可操作性和便捷性优势。 因此研究以5 dpf 斑马鱼为对象，采用单糖GLU 单独或与ALX 诱导药物联合探讨建立基于生理的和病理生理的糖代谢异常斑马鱼模型，为降糖药物的筛选和健康功能饮品开发提供新的策略。

GLU 是机体的主要供能物质， 可以在肠道上皮细胞葡萄糖转运蛋白的辅助下从肠道内直接吸收[11]。 研究发现，将斑马鱼幼鱼直接暴露于高GLU溶液中可以诱导建立基于生理的糖代谢异常斑马鱼模型，这与GLU 在肠道内的直接吸收方式是有关的，当摄入量超过消耗量，机体的GLU 显著增加。ALX 是嘧啶的一种含氧衍生物，通过产生氧自由基来选择性地破坏胰岛β 细胞，引起细胞死亡，最终导致胰岛素分泌量下降， 形成胰岛素依赖性糖尿病[12]。 研究还发现，将斑马鱼幼鱼暴露于高GLU 与ALX 溶液中可以进一步提升斑马鱼GLU值，可建立基于病理生理的糖代谢异常（糖尿病）模型。

在外源营养物质吸收和体重变化方面， 给予高糖溶液孵育体重跟不给予组相比体重有增加趋势， 这可能与外源营养供应促进和提高幼鱼的生长发育速度有关。 在均给予高糖溶液孵育的条件下，ALX 的给予在一定程度上降低了从孵育液中吸收外源能量物质的量，体重有减轻趋势，但斑马鱼GLU 值显著增加， 推测ALX 造成机体胰岛损伤后可能下调了外源物质吸收， 体内GLU 利用效率降低，在机体供需补偿下却促进了内源物质的消耗，进而呈现出体重下降和体内GLU 累积增加[17-18]。 因孵育时间较短，长时孵育下是否发现明显规律性变化还需进一步研究与分析。

基于已建立的的生理的和病理生理的斑马鱼模型， 研究发现 250、500 和 750 μg/mL CP 可以显著降低22 mg/mL GLU 诱导的斑马鱼GLU 值。更重要的是，250 μg/mL 可以显著降低糖尿病斑马鱼（22 mg/mL GLU+0.02 mM ALX 联合孵育 24 h）GLU 值，并改善机体的健康状态。 GLU 是最基础的营养物质， 其进入肠道内可以直接被吸收，因而CP 在研究中的降糖效应与抑制外源糖类在肠道内的消化作用是无关的， 同时综合孵育液中GLU 水平和斑马鱼体重变化， 推测可能的降糖作用机制与减轻斑马鱼卵黄囊消耗， 改善机体健康状态[20]，促进胰岛素分泌[21]提高体内GLU利用率[22-24]有关。

另外结合当前大小鼠动物实验揭示，CP 还可能具有保护并改善肝脏异常代谢[25-26]，保持血脂稳定，增强抗氧化，保护胰腺等相关作用[27-28]。劳乔聪等[15]基于40 mg/mL 蔗糖与1 mM ALX 联用建立糖尿病斑马鱼模型， 研究发现1000 和2000 μg/mL CP 可以显著降低血糖值， 且降糖效果呈浓度依赖性。姚骏凯等[21]研究发现CP 可以降低糖尿病大鼠胰腺可溶性细胞凋亡因子配体、 可溶性细胞凋亡因子、 活化半胱氨酸蛋白酶8 含量以及磷酸化c-Jun 氨基端激酶1 和总c-Jun 氨基端激酶1的表达量， 表明CP 降血糖作用机制可能与抑制胰腺β 细胞凋亡有关。姚骏凯等[20]研究发现CP 可以显著降低糖尿病大鼠空腹血糖和胰岛素抵抗指数，显著增加胰岛素受体底物1 蛋白mRNA 的表达， 以及肝脏磷酸化胰岛素受体底物1/胰岛素受体底物1 蛋白比值。 肝脏在糖脂代谢中发挥重要作用。 另外研究还发现[25-26]CP 可以抑制糖尿病大鼠肝脏组织中与脂肪酸代谢、 依赖于细胞色素P450 的异物代谢等过程， 同时还下调了miR-200a-3p、miR-100-3p、miR-375-3p 和 miR-221-5p 的表达， 表明CP 具有改善肝脏异常代谢来预防糖尿病的作用[20-21]。

下一步工作将围绕已建立的基于生理和病理生理的糖代谢异常模型，开展CP 毒理学（安全性评价和剂量学估算）研究，尤其是充分结合斑马鱼幼鱼透明和可以进行活体染色镜检的显著优势开展器官药物毒理损伤作用研究， 以及以我国食品上准入的药用植物资源为核心开展复方配伍降糖增效作用研究， 为健康功能食品或饮品开发提供基础理论和基础数据支撑。

4 结论

研究以5 dpf 斑马鱼为对象， 采用22 mg/mL GLU 单独或与0.02 和0.04 mM ALX 溶液联合孵育24 h 探索建立了基于生理的和病理生理的糖代谢异常斑马鱼模型。结果显示，相较于0 mg/mL GLU 组 ，22 mg/mL GLU 单 独 或 与 0.02 和 0.04 mM ALX 联合处理组斑马鱼GLU 值显著增加，分别增加了 6.80 倍 （p＜0.05）、7.52 倍 （p＜0.05）和9.15 倍（p＜0.05）。 采用临床常用糖尿病治疗药物ACA 进行评价，研究发现与模型组相比，250、500和750 μg/mL ACA 治疗可以显著降低糖尿病斑马 鱼 GLU 值 ， 分 别 降 低 了 55.10% （p ＜0.05）、50.17%（p＜0.05） 和 44.31%（p＜0.05）， 表明以 22 mg/mL 与0.02 mM ALX 溶液联合建立的糖尿病斑马鱼是有效的。 经斑马鱼模型评价， 相比模型组，250、500 和 750 μg/mL CP 可以显著降低 22 mg/mL 诱导的斑马鱼 GLU 值， 分别降低了41.67%、48.33%和60.97%，差异均显著（p＜0.05）；250 μg/mL CP 治疗可以显著降低22 mg/mL GLU与0.02 ALX 溶液处理的斑马鱼GLU 值， 降低了29.97%（p＜0.05），另对体重有一定的改善作用。 结果表明，CP 具有明显的降糖效应， 其降糖机制可能与改善机体的健康状态和促进GLU 的利用有关， 其在辅助降血糖功能食品饮料开发上具有广阔的应用前景。