基于糖代谢异常斑马鱼模型评价代用茶沙棘叶的降糖作用

刘均 ，李强 ，谭蓉 *

（1.中华全国供销合作总社杭州茶叶研究院，浙江杭州 310016；2.浙江省茶资源跨界应用技术重点实验室，浙江杭州 310016）

沙棘（Hippophae rhamnoides Linn）是一种落叶性灌木，具有耐旱、抗风沙特性，在我国西北地区有大量种植，主要用于水土保持和沙漠绿化。 沙棘是一种很重要的绿色生态资源，沙棘果中含有丰富的营养物质和功能活性物质，是我国藏、蒙医药的常用材料，具有健脾养胃、滋阴壮阳之功效[1-2]，广泛应用于食品、医药等领域，取得了良好的经济和社会效益。 相较于沙棘果资源的开发利用， 沙棘叶（Hippophae rhamnoides Linn. leaf，HRLL） 资源的利用目前还处于起步阶段。 HRLL 中也含有丰富的营养物质， 约含有20.7%粗蛋白、4.1%粗脂肪、15.6%粗纤维，是一种良好的饲料原料，但目前市场上尚无沙棘饲料。 此外，HRLL 还含有丰富的沙棘多糖、黄酮、多酚、三萜和甾体类化合物等功能活性成分[3]，是活性成分提制的重要原料，尤其是其中含有的科罗索酸，具有“植物中的胰岛素”之称，在糖尿病治疗上具有较高价值。 2013 年，根据中华人民共和国国家卫生健康委员会通告（2013年第 3 号），HRLL 被纳入普通食品管理， 标志HRLL 在我国食品和功能食品上的应用准入。 目前， 我国北方地区正积极开展HRLL 代用茶试制研究及产品开发，但尚无畅销产品。在HRLL 代用茶开发方面，主要存在两个问题，一是HRLL 表面白绒毛过多，泡饮时漂浮水表影响美观和消费者粘度；二是其泡饮下的全浸出物实际功效有待考证。

斑马鱼是一种新兴模式生物， 与人类基因的相似度达到87%， 通过在体研究可以有效弥补体外实验（细胞试验）和哺乳类动物实验（大小鼠）之间的生物学断层，完善现有药物研发体系。 而且，斑马鱼养殖方便、繁殖周期短、产卵量大、胚胎体外受精、体外发育、胚体透明，已成为生命科学研究的新宠。 目前利用斑马鱼，可以构建糖尿病[4-5]、高血脂[6-7]、高尿酸症[8-9]、失眠[10-11]等疾病模型，开展药物筛选、安全与毒理评价。 因此，研究以5 dpf（days post fertilization）斑马鱼为对象，系统研究了不同浓度不同孵育时间下斑马鱼对HRLL 耐受性的影响， 并指导基于正常生理和病理生理的糖代谢异常斑马鱼模型开展HRLL 降糖功效评价，为HRLL 健康茶饮开发提供基础理论和数据支撑。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料制备

HRLL 鲜叶原料采摘自山西， 参照绿茶加工工艺制造。鲜叶经过萎凋后，先经260~280 ℃滚筒电热杀青，摊凉后揉捻机揉捻30 min，110~120 ℃炒干制成卷曲形颗粒产品。 采用类似茶叶泡饮提取方法（料水比1：20）制备贮备液：称取5 g HRLL于烧杯中，在80 ℃恒温水浴锅中浸提3 次，每次浸提30 min， 合并滤液并定容至100 mL 制得50 mg/mL HRLL （以生药量计） 贮备液，4 ℃冷藏备用。准确量取 0、0.025、0.050、0.10、0.20、0.40、0.80、1.00、2.00、4.00、8.00 和 10.00 mL 上述 HRLL 储备液， 加蒸馏水定容至 50 mL， 分别制成 0、25、50、100、200、400、800、1000、2000、4000、8000、10000 μg/mL 的 HRLL 溶液， 用于开展斑马鱼对不同浓度HRLL 溶液耐受性的影响研究。

1.1.2 试验仪器

全自动智能型生化（霉菌）培养箱（天津市宏诺仪器有限公司）；离心机（3K1S，德国 sigma 离心机公司）；手持式高速匀浆机（MY-20，上海净信实业发展有限公司）；酶标仪（Multiskan SkyHigh， 赛默飞世尔科技（中国）有限公司）；精密电子天平（AL-204，梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司）；水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；杀青机（6CSM-40 型，浙江春江茶叶机械有限公司）；揉捻机（6CRM-25 型，浙江春江茶叶机械有限公司）；双锅曲毫机（6CCQ-50 型，浙江春江茶叶机械有限公司）。

1.1.3 试验试剂

四氧嘧啶（ALX，CAS 号：2244-11-3，纯度≥98.0 mg/mL）；阿卡波糖（Acarbose，ACA，拜耳医药保健有限公司）；葡萄糖（glucose，GLU，国药集团化学试剂有限公司）；GLU 检测试剂盒 （葡萄糖氧化酶法，南京建成生物工程研究所）；三卡因甲磺酸（CAS 号：886-86-2，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；磷酸缓冲盐溶液（pH 7.02，南京建成生物工程研究所）。

1.1.4 试验动物

斑马鱼（3 月龄，AB 型，上海费曦生物科技有限公司）。 斑马鱼胚胎的繁殖以自然交配方式进行。 每个产卵盒中按1：1 放入公鱼和母鱼， 放入28.5 ℃恒温培养箱中。采用光周期为：14 h 光照与10 小时黑暗，于第二天上午收集胚胎，去除死卵和粪便，清洗后换孵育水（60 μg/mL 海盐水），置于28.5 ℃恒温培养箱中恒温孵育，每24 h 换水一次，并去掉卵膜和死卵。 实验完成后，用三卡因甲磺酸对暴露将斑马鱼麻醉处死。

1.2 实验方法

1.2.1 斑马鱼对HRLL 的耐受性分析研究

将5 dpf 野生型AB 系斑马鱼随机分为 12组，每组 3 个重复，每个重复15 条，分别给予0、25、50、100、200、400、800、1000、2000、4000、8000、10000 μg/mL HRLL 溶液（以生药量计），并分别记为 T0~T10000， 每孔加药物 5 mL 置于 28.5 ℃培养箱中培养。 每24 h 换水一次，记录死亡数量，计算死亡率。

1.2.2 HRLL 对基于正常生理和病理生理的斑马鱼模型的降糖作用研究

（1） HRLL 对高糖诱导斑马鱼模型降糖作用

基于HRLL 耐受性分析，按照HRLL 的10%~25% LC50剂量浓度[12-13]略作调整，评价用 HRLL 的剂量下限为 200 μg/mL，同时设置 400 和 800 μg/mL 剂量浓度开展降糖作用研究。 将5 dpf 野生型AB 系斑马鱼随机分为5 组，每组3 个重复，每个重复 15 条， 分别给予 0 mg/mL GLU+0 μg/mL HRLL、10 mg/mL GLU+0 μg/mL HRLL、10 mg/mL GLU+200 μg/mL HRLL、10 mg/mL GLU+400 μg/mL HRLL、10 mg/mL GLU+800 μg/mL HRLL 溶液，且分别记为 C1、C2、T1、T2 和 T3，每孔加药物5 ml，置于28.5 ℃培养箱中培养24 h，每个重复取10 条鱼， 加入100 μL 磷酸缓冲盐溶液匀浆后用于测定GLU 含量。 研究主要基于糖代谢异常斑马鱼模型评估HRLL 控糖作用。

（2） HRLL 处理对糖尿病斑马鱼模型降糖作用

基于前期研究， 将5 dpf 野生型AB 系斑马鱼，给予10 mg/mL GLU+0.025 mM ALX 联合孵育24 h 以构建诱导糖尿病模型，每组3 个重复，每个重复15 条。 待孵育24 h 后， 再分别给予 10 mg/mL GLU 与 200、400 和 800 μg/mL HRLL 或 400 μg/mL ACA 联合孵育 24 h， 分别记为 CM、 THRLL200、T-HRLL400、T-HRLL800、T-ACA400。同步设置正常斑马鱼采用0 mg/mL GLU 孵育48 h（期间24 h 换液一次）作为空白对照，记为CK。试验结束时，每个重复取10 条鱼，加入200 μL 磷酸缓冲盐溶液匀浆后用于测定GLU 含量。 研究主要基于糖尿病斑马鱼模型评估HRLL 的降糖作用。

1.3 检测方法

GLU 含量检测按如下步骤进行： 取适量磷酸缓冲盐溶液于装鱼的1.5 mL 离心管中，采用高速手持式匀浆机匀浆1 min， 直至鱼体组织裂解充分，然后于4 ℃下以2500 r/s 离心10 min，结束后取上清样 2.5 μL 采用 GLU 检测试剂盒 （GLU 氧化酶法）测定GLU 浓度，其测定程序和方法按照试剂盒说明书规定的步骤进行。

1.4 统计分析

所有试验数据经Excel 2016 初步处理后，用Graphpad Prism 6.0 绘图，并用SPSS Statistics 17.0进行单因素方差分析（One-way ANOVA），所有数据均以平均值±标准差呈现， 差异显著性采用Duncan 分析并将进行多重比较，p＜0.05 表示组间差异显著。 利用 SPSS17.0 软件中 Regression 中PROBIT 程序计算其 LC50。

2 结果与讨论

2.1 斑马鱼对HRLL 的耐受性分析

不同浓度HRLL 及孵育时间对斑马鱼幼鱼死亡率的影响见图1。 5 dpf 斑马鱼幼鱼对高浓度HRLL 具有不耐受性， 当HRLL 浓度小于等于1000 μg/mL 时死亡率较低， 死亡率在10%以下，当浓度大于等于2000 μg/mL 死亡率陡增，死亡率超过 50%。 以孵育 24 h 为基准， 采用SPSS 中PROBIT 程序分析得出斑马鱼的HRLL 耐受性如表1 所示， 死亡率与 HRLL 浓度间的关系为：probit（p）=-2.423+0.000977x，按该模型计算得出HRLL 的 LC50为 2479.41 μg/mL，95%可信范围为2081.20~3034.93 μg/mL。 因此，若按照 10%~25%LC50剂量浓度 HRLL 的适宜剂量浓度范围为247.94~619.85 μg/mL。

图1 不同沙棘叶浓度及孵育时间对斑马鱼幼鱼死亡率的影响Fig. 1 Effects of different concentrations of Hippophae rhamnoides Linn. leaf and incubation time on the lethallty rate of zebrafish larvae

表1 斑马鱼幼鱼沙棘叶耐受性影响的参数估计表Table 1 Parameter estimates of Hippophae rhamnoides Linn.leaf tolerance in zebrafish larvae

2.2 HRLL 对基于正常生理和病理生理的斑马鱼模型的降糖作用研究

2.2.1 HRLL 对高糖诱导斑马鱼模型降糖作用的影响

根据斑马鱼对HRLL 耐受性的分析结果，按照10%~25% LC50推荐量略作调整，选用200、400和800 μg/mL 剂量梯度组合开展HRLL 降糖作用研究，其对基于正常生理的斑马鱼GLU 值的影响见图 2。 研究发现， 与 C1 组相比，C2 组斑马鱼GLU 值显著增加，达到 126.68%（p＜0.05）。 另外与C2 组相比，T1、T2 和 T3 组斑马鱼 GLU 值显著降低，分别降低了 33.06%（p＜0.05）、37.54%（p＜0.05）和 54.29%（p＜0.05）， 表明 HRLL 对高糖溶液诱导的正常生理的斑马鱼具有降糖效应。

图2 沙棘叶对高糖诱导斑马鱼葡萄糖值的影响Fig.2 Effects of Hippophae rhamnoides Linn. leaf on the values of glucose of high glucose solutioninduced zebrafish

2.2.2 HRLL 处理对糖尿病斑马鱼模型降糖作用的影响

HRLL 对糖尿病斑马鱼GLU 值的影响见图3。与CK 组相比，CM 组斑马鱼 GLU 值从 0.045 mM增加到 0.111 mM，增长了 148.54%（p＜0.05）。 相比 CM 组 ，T -HRLL200、T -HRLL400 和 T -HRLL800 组斑马鱼GLU 值分别降低了42.22%、64.47%和 59.49%， 均差异显著 （p＜0.05）。 TACA400 组 斑马鱼 GLU 值降低 了 78.30%（p ＜0.05）。 结果表明，HRLL 对糖尿病斑马鱼明显的降糖效应， 但在同等剂量浓度下降糖作用弱于ACA。

图3 沙棘叶对糖尿病斑马鱼葡萄糖值的影响Fig. 3 Effects of Hippophae rhamnoides Linn. leaf on the values of glucose of diabetic zebrafish

3 讨论

GLU 是最基本糖类物质， 可以在肠道上皮细胞葡萄糖转运蛋白（GLUT）的辅助下从肠道内直接被吸收[14]。 研究发现，将斑马鱼幼鱼直接暴露于10 mg/mL GLU 溶液中， 可以增加斑马鱼GLU 值， 这与 GLU 的吸收方式有关。 ALX 是嘧啶的一种含氧衍生物，通过选择性地破坏胰岛β细胞，导致胰岛素分泌量下降，形成胰岛素依赖性糖尿病[15]。 前期研究发现，以10 mg/mL GLU和0.025 mM ALX 联合诱导24 h 可以显著增加斑马鱼 GLU 值。 因此，研究以 10 mg/mL GLU 单独或与0.025 mM ALX 联合建立基于正常生理的和病理生理的糖代谢异常斑马鱼模型，在系统研究不同HRLL 浓度不同孵育时间下对斑马鱼幼鱼生物耐受性的影响下指导开展了HRLL 水提物降糖效应评价，为HRLL 健康茶饮开发提供基础信息。

研究发现，5 dpf 斑马鱼对高浓度的HRLL 水提物具有不耐受性， 孵育 24 h 时的 LC50为2479.41 μg/mL，在安全剂量范围内的研究结果表明，200、400 和 800 μg/mL HRLL 均具有明确的降糖作用，且降糖效应呈一定的剂量依赖，推测与其内含的功能活性物质有关。 HRLL 中含有沙棘蛋白、黄酮类、多酚类、三萜和甾体类化合物等多种功能活性成分[15-17]，尤其是含有科罗索酸，有“植物中的胰岛素”[18]之称，HRLL 中约含有0.055%科罗索酸[18]。 田晓东[18]以 HRLL 为原料提取制备了含有2.14%科罗索酸的HRLL 粗提物，发现 0.94 和1.88 g/kg HRLL 粗提物和 20 mg/kg科罗索酸处理可以显著降低糖尿病大鼠的血糖，显著增强肝脏超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶活性，其降糖机制可能与提升机体的抗氧化能力，清除体内自由基进而保护胰腺和肝脏等器官有关。 张璐[19]研究发现含三萜酸沙棘粗提物（内含2.14%的科罗索酸）可以显著降低大鼠空腹血糖、 改善糖耐量及胰岛素抵抗。另外，沙棘蛋白和沙棘黄酮也具有一定的降糖作用。 刘洪霞等[20]研究发现以50 mg/kg 沙棘蛋白连续灌胃8 周可以显著降低2 型糖尿病模型db/db小鼠血糖。 舒丹阳等[21]研究发现以 50、150 和250 mg/kg/d 沙棘籽蛋白肽连续灌胃8 周，可以显著降低2 型糖尿病小鼠血糖水平。 杨阔[22]通过体外细胞实验研究发现，50~200 μg/mL 沙棘黄酮可以显著促进分化成熟的3T3-L1 脂肪细胞和C2C12 骨骼肌细胞对葡萄糖的摄取。 沙棘黄酮可以激活上述两种细胞内的AMP 依赖的蛋白激酶（AMPK）信号通路，上调p-AMPK 的蛋白表达水平， 促进 GLUT4 蛋白转位到细胞膜上， 抑制PPARγ 及其磷酸化蛋白的表达，表明沙棘黄酮通过激活AMPK 信号通路来促进细胞对葡萄糖的摄取。

相较于大小鼠功能评价体系， 试验采用的5 dpf 斑马鱼评价技术具有孵育喂养（饲养）时间短，诱导24 h 建模具有实验周期短，采用多孔板操作实验便捷等特点，不仅可以有效节约成本，还可以有效缩短试验周期。 此外研究借鉴日常茶叶泡饮法，重点研究HRLL 全浸出物的实际功效评价，采用的斑马鱼高通量筛选模型是可以快速、 准确筛选最优作用剂量浓度的最佳方案， 也为下一步最优剂量优选提供了基础和参考信息。

4 结论

5 dpf 斑马鱼对高浓度的HRLL 具有不耐受性， 孵育 24 h 时的 HRLL 的 LC50为 2479.41 μg/mL，95%可信范围为 2081.20~3034.93 μg/mL。 按照10%~25% LC50剂量浓度推荐并略作调整，选用 200、400 和 800 μg/mL HRLL 开展了基于正常生理的和病理生理的糖代谢异常斑马鱼模型的降糖作用评价。结果发现，在10 mg/mL GLU 诱导斑马鱼模型中，200、400 和 800 μg/mL HRLL 处理斑马鱼 GLU 值分别降低了 33.06%（p＜0.05）、37.54%（p＜0.05）和 54.29%（p＜0.05）；在 10 mg/mL GLU 和0.025 mM ALX 诱导的糖尿病斑马鱼模型中，200、400 和 800 μg/mL HRLL 处理组斑马鱼GLU 值分别降低了 42.22%（p＜0.05）、64.47%（p＜0.05）和 59.49%（p＜0.05）。 结果表明，基于斑马鱼生物模型评价，200、400 和 800 μg/mL HRLL 具有明确的降糖作用。 下一步还将继续开展构建基于稳定可靠的斑马鱼模型，开展毒理学安全性评价和剂量学估算研究，开展降糖作用及其调节机制研究。 我国是中药材资源型大国，很多药用植物在系统功能上具有协同效应，还需进一步开展以HRLL 为核心的组方配伍研究及功能评价研究，开发具有辅助降糖效应的健康茶饮产品。