理筋手法干预对颈后肌慢性损伤家兔β-EP、ENK、5-HT动态变化的影响

袁兰英 马惠昇,2* 穆 静 李嫚嫚 李彦双 孙文静

1.宁夏医科大学中医学院，银川 750004；2.宁夏医科大学回医药现代化省部共建教育部重点实验室，银川 750004

随着工作和生活中电子设备的广泛应用，教师及职场工作者等人群持续长时间低头伏案工作频率大大增加[1]。颈部采取低头位、颈前伸的姿势，来代偿颈部胸锁乳突肌、斜方肌、颈后肌群高度紧张现象，造成出现颈部自觉不适、颈后肌群僵硬疼痛、头痛等问题[2-3]。虽然在疼痛初期经休息后可缓解，但是易复发，长期持续会诱发颈部疾病产生，增加了治疗成本，又对人们的工作生活产生长期的影响[4-5]。唐代孙思邈在《备急千金要方·卷九》中指出：“凡人有少苦似不如平常，即须早道，当若隐忍不治，希望自差，须臾之间，已成痼疾。”[6]也认为当身体出现不适时，如果勉强忍受不进行干预，过不了多久不适感就会形成顽疾。因此，当处于未病的状态时就要通过干预防止其进一步发展成为疾病，实现“上医医未病之病”理念的同时解除患者的痛苦。研究[7-8]发现，中枢镇痛机制中激活内源性阿片肽ENK与β-EP能够达到镇痛的作用，外周中β-EP、5-HT作为经典的致痛递质，也参与痛敏形成的过程。课题组在前期研究中发现理筋手法干预治疗颈后肌慢性损伤疗效显著[9]，但其如何发挥干预疾病形成的机制尚不明确。本研究通过建立家兔颈后肌慢性损伤模型，研究理筋手法对家兔颈后肌慢性损伤相关因子β-EP、ENK、5-HT含量的影响，探索理筋手法对人颈后肌慢性损伤的干预机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选用普通级健康日本大耳家兔63只，6月龄，雌雄各半，体重(2.0±0.5)kg，由陕西君行生物科技有限公司提供[许可证号：SCXK(陕)2017-001]，在宁夏医科大学双怡校区实验动物中心进行饲养。实验所用家兔分笼饲养，食用标准兔饲料和水，自由饮食。室温15～20 ℃，湿度50%～60%。

1.2 分组及造模方法 63只成年家兔适应性喂养1周，在观察其饮食、粪便、活动均无异常后开始实验。按照标准随机数字表法，将63只家兔随机分为正常对照组组、模型组、干预组，每组21只。由专人定时定量喂养。根据前期课题组实验，参照刘志华等[10]所改良的颈部模型固定架建立兔颈后肌慢性损伤模型。根据前期课题组对兔慢性静力性损伤造模方式、造模持续时间的反复研究，最终采用每日1次，一次5 h，固定60 d的方式进行慢性静力性损伤造模。

1.3 干预方法 正常对照组组家兔正常饲养，不进行造模与干预。模型组家兔在每天造模结束后不予任何处理。干预组家兔在每天造模结束后，立即给予理筋手法干预；由专业人员先在推拿手法测定仪上进行手法力量、频率等动力学参数训练，待松筋、顺筋手法的动力学参数稳定后对家兔颈后肌处施以松筋、拨筋、顺筋的手法治疗，治疗时手法刺激量以家兔不躁动为宜。理筋手法干预每天1次，每次10～15 min。

1.4 组织标本的采集 在造模后的第20天、40天、60天对各组家兔经耳缘静脉采集静脉血10 mL，于-20 ℃冰箱中冻存备用。空气栓塞法处死各组家兔，剥离颈后皮肤充分暴露颈后肌，取1 cm×1 cm×0.5 cm颈后肌组织，生理盐水冲洗后放入标记好的包埋盒中，然后置于4%的多聚甲醛固定液中，用于HE染色。将颈段的肌肉与脊柱拨离，用咬骨剪小心剪下颈段脊柱，并用棉签取出颈段脊髓快速置于EP管中。再取出兔的下丘脑置于EP管中。将取好的样本快速放入-80 ℃低温冰箱保存，用于ELISA检测。

1.5 HE染色观察颈后肌组织形态学结构变化 将4%的多聚甲醛固定液中的肌组织，按照操作顺序，依次脱水、浸蜡、包埋、切片、染色后，再经脱水、透明、封固后在光学显微镜下观察细胞核、胞浆、纤维组织染色情况，观察炎症、炎细胞浸润情况。

1.6 ELISA分别检测颈部中枢β-EP、ENK及外周β-EP与5-HT含量 检测颈后肌组织、脊髓、下丘脑中β-EP、ENK与5-HT含量时，从-80°低温冰箱中快速取出各类待测标本，融化后维持在4 ℃左右，加入一定量PBS将标本进行匀浆处理，匀浆充分后，2000 r·min-1离心20 min，收集上清。按照β-EP、ENK、5-HT的ELISA试剂盒说明书进行操作，于450 nm波长处在酶标仪上读取各孔的吸光度(OD)值。以OD值为纵坐标,相应的标准品含量为横坐标，绘制标准曲线。

检测血浆中β-EP与5-HT含量，取出-80 ℃存放的血浆，恢复至4 ℃左右后添加抗凝剂EDTA混合15 min，2000 r/min离心20 min，收集上清。使用ELISA试剂盒检测血浆中β-EP与5-HT含量，方法同上。

2 结果

2.1 家兔颈后肌局部组织形态结构变化 在光学显微镜下观察肌纤维如图1所示，正常对照组处颈后肌肌纤维整齐排列，间隙大致相同。第20天时模型组出现肌原纤维排列紊乱、肌丝扭曲的现象；干预组相较于模型组，肌原纤维紊乱程度较轻；第40天模型组可见肌原纤维排列紊乱、疏松，肌间隙不规则增宽变窄，有少量炎性细胞浸润；干预组可见局部肌原纤维排列紊乱、扭曲程度较轻，肌间隙增宽；第60天模型组可见肌原纤维排列紊乱、大幅度扭曲变形，间隙不规则变窄，大量炎性细胞浸润；干预组肌纤维变化较模型组肌纤维排列紊乱、扭曲幅度小。

空白组(20 d) 模型组(20 d) 治疗组(20 d)

空白组(40 d) 模型组(40 d) 治疗组(40 d)

空白组(60 d) 模型组(40 d) 治疗组(40 d)图1 骨骼肌慢性静力性损伤后组织形态学变化(HE染色，×200)

2.2 各组家兔颈部中枢(脊髓与下丘脑)内β-EP含量的比较 如表1所示，组间比较中，与正常对照组兔中枢β-EP含量相比，同期三个观察点处模型组β-EP含量均降低(P<0.05)；与模型组中枢β-EP含量相比，第40天时，干预组脊髓β-EP含量升高(P<0.05)；第60天时，干预组下丘脑β-EP 含量升高(P<0.05)。组内比较中，与模型组第40天中枢β-EP含量相比，第60天脊髓β-EP含量升高(P<0.05)。与干预组第40天中枢β-EP含量比较，第20天下丘脑β-EP含量升高(P<0.05)。

表1 各组家兔中枢(脊髓与下丘脑)中β-EP含量比较

表1 各组家兔中枢(脊髓与下丘脑)中β-EP含量比较

组别 20 d(n=7) 40 d(n=7) 60 d(n=7) 脊髓下丘脑脊髓下丘脑脊髓下丘脑正常对照组914.90±30.38909.62±38.34917.88±30.29921.16±27.95918.91±27.97910.73±29.55模型组838.01±59.95△826.14±29.64△817.56±33.39△839.82±40.48△865.56±46.89△▲812.52±45.12△干预组873.42±50.01867.96±45.92◆889.97±37.37☆805.39±39.98△914.90±30.38919.35±28.02☆

注：与同一时间点正常对照组比较，△P<0.05；与同一时间点模型组比较，☆P<0.05；与40 d模型组比较，▲P<0.05；与40 d干预组比较，◆P<0.05。

2.3 各组家兔颈部中枢(脊髓与下丘脑)内ENK含量的比较 如表2所示，组间比较中，与正常对照组兔中枢ENK含量相比，同期三个观察点处模型组含量均降低(P<0.05)；与模型组中枢ENK 含量相比，同期三个观察点处，干预组ENK 含量升高(P<0.05)。组内比较中，与模型组第40天中枢ENK含量相比，第60天ENK含量降低(P<0.05)。与干预组第40天比较，第20天、 60天下丘脑ENK含量均降低(P<0.05)。

表2 各组家兔中枢(脊髓与下丘脑)中ENK含量比较

表2 各组家兔中枢(脊髓与下丘脑)中ENK含量比较

组别 20 d(n=7) 40 d(n=7) 60 d(n=7) 脊髓下丘脑脊髓下丘脑脊髓下丘脑正常对照组493.00±19.85512.11±16.86481.19±20.65509.01±20.68482.27±17.11505.58±21.04模型组393.94±26.71△433.13±20.16△393.47±18.45△433.42±24.56△382.32±11.00△▲404.46±8.42△▲干预组466.57±27.28☆ 481.42±23.56△☆◆461.61±13.85☆506.52±29.70☆ 425.06±9.51△☆◆ 398.42±16.67△◆

注：与同一时间点正常对照组比较，△P<0.05；与同一时间点模型组比较，☆P<0.05；与40 d模型组比较,▲P<0.05；与40 d干预组比较,◆P<0.05。

2.4 各组家兔颈部外周(颈后肌组织与血浆)内β-EP含量的比较 如表3所示，组间比较中，与正常对照组兔外周β-EP含量相比，同期三个观察点处模型组含量均降低(P<0.05)；与模型组外周β-EP含量相比，同期三个观察点处，干预组颈后肌组织、血浆β-EP含量升高(P<0.05)。组内比较中，与模型组、干预组第40天外周β-EP含量相比，第20天β-EP含量均升高(P<0.05)。

表3 各组家兔外周(颈后肌组织与血浆)中β-EP含量比较

表3 各组家兔外周(颈后肌组织与血浆)中β-EP含量比较

组别 20 d(n=7) 40 d(n=7) 60 d(n=7) 颈后肌组织血浆颈后肌组织血浆颈后肌组织血浆正常对照组877.00±36.27806.97±35.29876.24±37.65811.84±32.98881.94±35.80812.31±33.19模型组760.68±64.41△▲761.38±28.32△▲710.53±35.72△652.60±43.09△665.41±26.67△▲663.77±47.86△干预组827.56±19.73△☆◆785.63±39.78△☆◆797.46±42.46△☆720.55±49.34△☆834.28±25.29△☆◆811.15±33.81△☆

注：与同一时间点正常对照组比较，△P<0.05；与同一时间点模型组比较，☆P<0.05；与40 d模型组比较，▲P<0.05；与40 d干预组比较,◆P<0.05。

2.5 各组家兔颈部外周(颈后肌组织与血浆)中5-HT含量比较 如表4所示，组间比较中，与正常对照组兔外周5-HT含量相比，同期三个观察点处模型组颈后肌组织5-HT含量升高(P<0.05)，第40天、60天时，模型组血浆5-HT含量升高(P<0.05)；与模型组外周5-HT含量相比，同期三个观察点处，干预组5-HT含量降低(P<0.05)。组内比较中，与模型组第40天外周5-HT含量相比，第20天时颈后肌组织5-HT含量降低(P<0.05)，第60天时血浆中5-HT含量升高(P<0.05)。与干预组第40天外周5-HT含量相比，在第20天颈后肌组织5-HT含量升高(P<0.05)。

表4 各组家兔颈后肌组织及血浆内5-HT含量比较

3 讨论

慢性静力性损伤是一种长期逐渐积累的细微损伤，国外学者[11]主要通过物理治疗配合药物治疗来缓解局部疼痛不适，物理疗法主要依据肌膜学、人体力学、人体解剖学理论进行治疗。理筋手法是国外损伤医学与中医学肌膜理论的高度融合形成的专门针对筋伤类疾病的治疗方法，针对性强，临床疗效显著。课题组在长期的临床实践中发现理筋手法在治疗颈椎病中能够明显缓解疼痛、提高人们的生活质量,能够治疗颈部筋伤，明显减轻颈部酸痛不适，改善患者颈部活动度(总治愈率>90%)[12]。本实验通过建立家兔颈后肌慢性静力性损伤模型，采用理筋手法进行，通过观察中枢(脊髓、下丘脑)中β-EP、ENK和外周(颈后肌组织、血浆)中β-EP、5-HT含量的变化，探讨采用理筋手法干预对慢性静力性损伤的镇痛效应。实验通过一般形态学观察可观察到干预组第40天时肌原纤维紊乱、扭曲程度较模型组有明显改善，说明理筋手法在损伤中早期时就进行干预，能够减轻肌纤维的扭曲、变形，减缓炎性细胞浸润的速度，从而缩短骨骼肌静力性损伤后的修复时间。

β-EP亦称安多芬或脑内啡，是一种内成性(脑下垂体分泌)的类吗啡生物化学合成物激素。β-EP是存在于体内镇痛作用最重要的内源性阿片肽，主要作用于β受体而产生镇痛作用。由于β-EP肽链不易受酶裂解，故较其他种类内源性阿片肽增多了与受体结合的结构，因此镇痛作用强而持久。陈艳伟[13]研究发现，手法镇痛是刺激施术部位局部肌肉内β-EP的含量增加而达到镇痛的效果。尚坤等[14]通过背部推拿疗法有效促进β-EP 在体内的合成、分泌与分布，从而发挥其预防疾病、保健身体的作用。本次实验研究发现，经理筋手法干预后，理筋手法干预组的β-EP含量均有不同程度的升高，说明理筋手法能够通过调控β-EP含量的表达发挥镇痛作用；其中与模型组第40天脊髓β-EP含量相比，干预组第40天脊髓β-EP含量显著升高，说明理筋手法在干预中期能够通过合成或释放脊髓中β-EP物质，而产生镇痛作用。在干预组中期下丘脑中β-EP含量与模型组相比有所下降，可能是由于局部炎症刺激所导致。与模型组相比，干预组早中晚三期外周(软组织、血浆)中β-EP含量均有显著差异(P<0.05)；说明理筋手法干预能够激活内源性镇痛物质，促进β-EP的升高，抑制痛觉信号的释放和传递，实现镇痛作用。

ENK又称脑啡肽，是一种内源性阿片肽类物质，是中枢系统中主要参与机体内疼痛反应调节的主要内源性镇痛物质。ENK在脊髓中释放能够抑制伤害性P物质的释放[15]。实验发现，干预组、模型组ENK的含量均降低，可能是慢性静力性损伤导致的积累性损伤产生痛觉过敏，导致疼痛持续时间长，使表达量均有降低。但是经理筋手法干预后，中早期干预组ENK的含量均显著升高；晚期下丘脑ENK的含量降低；理筋手法干预40 d较干预60 d ENK的含量有所降低；说明在中期理筋手法干预能够促进中枢内源性阿片肽类物质的释放，镇痛作用明显。晚期下丘脑ENK的含量降低可能是由于在干预晚期ENK上行与内源性阿片肽β-EP共同作用使下丘脑中ENK含量降低，共同抑制致痛性物质释放，从而达到减轻疼痛的目的。

5-HT又称为血清素(Serotonin)，它既是一种单胺类神经递质，也是一种血管活性物质。5-HT作为目前已知的神经递质之一，在中枢和外周中均有分布，但是由于分布位置不同所以对疼痛的刺激性大不相同。其中外周5-HT主要由胃肠道的APUD细胞产生，释放入血，由血小板提取并储存在体内，在一定条件下释放入血，有较强的收缩血管与平滑肌的作用，还能够促进凝血，增加血管内膜通透性。同时外周5-HT受体能够形成下行的调控网络参与疼痛信号的传导，在外周的局部能够起到诱发甚至加重疼痛的作用[16]。本次实验发现，同期三个观察点处，模型组5-HT含量均升高，说明外周5-HT在痛觉传输中能够发挥重要的致痛作用；同时实验发现，在造模40 d时，模型组5-HT含量高于正常对照组5-HT含量、干预组。说明经理筋手法干预后能够降低外周5-HT的合成释放，减少激活神经末梢受体产生疼痛刺激。并且中早期就进行理筋手法干预，降低5-HT的合成和释放的效果显著。在与前期课题组研究[17]中发现外周血中游离的5-HT 是强烈的致痛物质，当机体受到伤害刺激时，游离的5-HT含量升高，引起疼痛刺激效应的结论一致，再次印证了降低外周血浆中5-HT含量对降低疼痛刺激的重要性。

综上所述，理筋手法可通过升高中枢(脊髓、下丘脑)β-EP、ENK、外周(颈后肌组织、血浆中)β-EP的表达量，降低外周(颈后肌组织、血浆中)5-HT的表达量，参与中枢、外周的镇痛过程。但是其中影响疼痛递质的具体调控机制尚不明确，后期还将对这一问题进行进一步深入研究。