马齿苋多糖对LPS诱导小鼠急性肺损伤的实验研究

黄小强 祝丹江 王鲁豫 陈雨田 孙嘉宁 黄 涛 贾 安

黄河科技学院医学院，河南 郑州 450063

急性肺损伤(Acute lung injury，ALI)是急诊科室中最常见的危重病之一，它的特点是肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞损伤，造成弥漫性肺间质及肺泡水肿，同时伴随蛋白质的渗出、大量炎症介质及因子的释放[1]。炎症细胞因子和相关介质伴随ALI的发生与发展全过程，例如TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS和NO等[2]。ALI在临床上具有较高的死亡率和发病率，其死亡率然高达40%～60%[3]。马齿苋为马齿苋科植物马齿苋(PortulacaoleraceaL.)的干燥地上部分，全国绝大地区均有分布，中国药典(2020版)记载具有清热解毒、凉血止血、止痢的功效[4]；由于富含多种营养成分，其中以维生素及ω-3脂肪酸最为突出，因此马齿苋也是一种营养价值较高的食物[5]。国内外学者研究[6-8]发现马齿苋的主要化学成分包括：多糖类、黄酮类、生物碱类、有机酚酸类等，同时药理学研究[9-12]发现，马齿苋多糖具有一定程度地降低炎症因子和护肝等作用。为了探讨马齿苋多糖是否对ALI的保护作用，本研究应用马齿苋多糖对LPS诱导ALI小鼠模型开展相关研究。为马齿苋今后进一步深入开发和临床应用提供一定参考。

1 材料与仪器

1.1 试药 马齿苋(张仲景大药房)；脂多糖(美国Sigma公司)；醋酸地塞米松片(遂成药业股份有限公司)；肿瘤坏死因子ɑ(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)和白介素6(IL-6)ELISA检测试剂盒(上海西塘生物科技有限公司)；髓过氧化物酶(MPO)活性检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 动物 60只清洁级KM雄性小鼠，体重18～20 g，由黄河科技学院医学院实验动物中心提供，动物房光照条件12 h/d，温度20～23 ℃，相对湿度40%～60%，小鼠适应性饲养7 d后用于实验。

1.3 仪器 多功能酶标仪(奥地利，Infinite公司)；高速台式冷冻离心机(美国，赛默飞世尔科技有限公司)；FY135型中草药粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；DHP-9052电热恒温培养箱(上海-恒科技有限公司)；BS-3000A系列电子天平(上海友声衡器有限公司)；光学显微镜(日本，OLYMPUS)；RM2125型石蜡切片机(德国，Leica公司)。

2 方法

2.1 药物制备

2.1.1 马齿苋多糖的制备[13-14]将马齿苋粗粉，过10目筛，称取500 g，加入4倍量无水乙醇浸泡24 h，抽滤，60 ℃烘干药渣，然后加入10倍量的蒸馏水，置于80 ℃水浴锅中温浸2 h，温浸提取2次，合并2次滤液，利用旋转蒸发仪减压浓缩至200 mL，然后加入800 mL无水乙醇至80%，剧烈摇匀，4 ℃低温静置分层，抽滤，收集沉淀，即为马齿苋粗多糖。沉淀完全溶于蒸馏水后加入适量活性炭进行脱色，抽滤，再加入少量Sevage试剂，充分震荡，静置分层，收集上清液，减压浓缩，并真空冷冻干燥，得马齿苋多糖，-20 ℃低温保存备用。采用硫酸-苯酚法对马齿苋多糖含量进行测定[15]，其工作曲线为C=3.6311A+0.0023，R2=0.9991，测定马齿苋多糖含量为62.22%

2.1.2 醋酸地塞米松溶液的制备 取适量将醋酸地塞米松片置于研钵中，充分研磨，用生理盐水配制成浓度为0.0005 g/mL的溶液，备用。

2.2 分组、造模与给药 将60只清洁级KM小鼠适应性饲养7 d后，随机分为6组：正常组，LPS型组，醋酸地塞米松组(0.005 g/kg·d)，马齿苋多糖低、中、高剂量组(1.5、3、6 g/kg/d，生药材)，每组10只，按10 mL/kg体重灌胃给药，每天给药1次，连续给药14 d，除正常组和LPS组小鼠给予等量常温生理盐水，其他各组给予相应体积的药物。末次给药后2 h，采用鼻腔滴注法慢慢滴注LPS生理盐水溶液(0.5 mL/kg)，正常组按照相同的方法给予相应体积的生理盐水[16]。建立模型[17]后小鼠禁食不禁水12 h，采用眼眶取血，随后脱臼处死，并迅速取出肺组织，备用。

2.3 肺组织W/D值计算[18]取小鼠右肺上叶，剔除肺组织上面结缔组织，同时利用滤纸吸尽组织表面水分和血液，并称量记录为肺组织湿重；随后将肺组织放置于温度为80 ℃干燥箱中连续干燥48 h后，称量记录为肺组织干重，计算(W/D)。

2.4 肺组织中MPO活性测定 取适量小鼠肺组织置于组织匀浆器中，按试剂盒说明书操作制备成5%的肺组织匀浆液，并检测MPO活性。

2.5 血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量测定 取血后，在低温条件下4000 r/min离心10 min分离血清，取上清；按照试剂盒说明书步骤，采用酶联免疫吸附剂法测定各组血清中TNF-α、IL-6、IL-1β的含量。

2.6 肺组织病理学检查 切下右肺组织下叶经4%多聚甲醛溶液固定24 h后，用蒸馏水冲洗至无多聚甲醛味；然后进行常规的石蜡包埋，切片厚度5 μm。进行切片脱蜡、苏木素-伊红染色、封片。在光学显微镜下进行病理学观察分析，根据肺泡壁厚度、肺组织破坏和炎症细胞浸润情况进行评分[19]。评分标准：0分=最小损伤；1分=轻度损伤；2分=中度损伤；3分=重度损伤；4分=最大损伤。肺损伤评分为3个指标评得分之总和。

3 结果

3.1 马齿苋多糖对肺组织W/D值的影响 与正常组比较，LPS组小鼠肺组织W/B值显著性升高(P<0.01)。与LPS组比较，经过马齿苋多糖干预后各剂量组小鼠W/B值均有不同程度降低，其中中剂量和高剂量组均具有统计学差异(P<0.05或0.01)。见表1。

3.2 马齿苋多糖对肺组织中MPO活性的影响 与正常组比较，LPS组小鼠肺组织中MPO活性显著性升高(P<0.01)。与LPS组比较，经过马齿苋多糖干预后各剂量组小鼠MPO活性均有不同程度降低，其中中剂量和高剂量组均具有统计学差异(P<0.05或<0.01)。见表2。

3.3 马齿苋多糖对血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量影响 与正常组比较，LPS组小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6含量均显著性升高(P<0.01)。与LPS组比较，经过马齿苋多糖干预后各剂量组小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6含量均有不同程度降低，其中中剂量和高剂量组均具有统计学差异(P<0.05或P<0.01)。见表3。

表1 各组小鼠肺组织W/D值的比较

表2 各组小鼠肺组织中MPO活性的比较

表3 各组小鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-1β含量的比较

3.4 马齿苋多糖对肺组织病理形态学的影响 正常组小鼠肺组织的结构清晰、无渗出液，同时也没有出现水肿及炎细胞浸润等现象。LPS组小鼠的肺组织出现明显的炎性浸润，肺泡间隔增厚及间质水肿等较为严重的病理损伤现象，与正常组比较，LPS组小鼠肺损伤评分显著性升高(P<0.01)。与LPS组比较，经过马齿苋多糖干预后各剂量组小鼠肺组织损伤均有不同程度的改善，同时肺损伤评分也有不同程度降低。如图1所示。

图1 各组小鼠肺组织病理形态学的变化图(×20) 注：与正常组比较，##P<0.01；与LPS组比较，*P<0.05,**P<0.01。

4 讨论

该研究通过鼻腔滴注LPS溶液建立ALI小鼠动物模型。在滴注LPS后2～4 h内可诱发ALI，在24～48 h内便可造成最大肺损伤[20]，该种方法可有效避免由于皮下注射LPS溶液引起的全身炎症反应和脏器官衰竭[21]。革兰阴性菌感染导致的肺炎是ALI最常见的诱导因素之一，由于LPS刺激巨噬细胞，从而导致机体大量释放TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子，进一步引发急性炎症反应[22]。目前国内外关于ALI的致病机制尚不明确，有学者[23]认为，ALI发生的主要原因是体内促炎和抗炎系统失衡。研究结果发现马齿苋多糖能够显著性降低TNF-α、IL-1β和IL-6炎症细胞含量，提示马齿苋多糖对LPS诱导的ALI作用与其抑制炎症因子分泌有关。

肺组织的W/D值大小在一定程度上反映了水肿的程度[24]，肺水肿程度与W/D值密切相关，W/D值越大则肺水肿程度越大，研究结果发现马齿苋多糖能够显著降低W/D值，从而缓解LPS所诱导的ALI。肺组织病理学观察发现LPS组小鼠肺组织损伤严重，通过马齿苋多糖干预后上述病理变化明显得到减轻。

综上，本研究结果显示：马齿苋多糖能够降低肺组织W/D值和肺组织中MPO活性，同时降低血清中TNF-α、IL-1β和IL-6炎症因子含量，提示马齿苋多糖对LPS所致的ALI具有一定的保护作用，其作用机制与抑制炎症因子分泌有关。