刷格痛风膏的质量标准研究

哈马莫支阿木 张英秀 张雪梅 冯维国 张志锋，3*

1.西南民族大学药学院，四川 成都 610225；2. 四川省北川羌族自治县中羌医医院， 四川 北川 622750；3. 四川省羌彝药用资源保护与利用技术工程实验室，四川 成都 610225

痛风与嘌呤代谢紊乱和(或)尿酸排泄减少所致的高尿酸血症直接相关，以关节红、肿、热、痛、功能障碍等为主要临床表现，是长期无症状高尿酸血症的结果[1-2]。羌医认为噜唔依基(痛风)是因为风吹过多而痛，又名“火烧样石头堵塞样痛”，属羌医“堵塞病”范畴。羌医认为痛风病位在四肢，特别脚拇趾掌关节好发，与脾胃和肝肾器官功能失调密切相关。脾胃和肝肾功能紊乱后产生火毒石，火毒石不在体内正常运转排泄，而是不断堆积在血管和内脏器官里，堵塞了正常运行的管道，从而使血液异常[3-4]。刷格痛风膏是北川羌族自治县中羌医医院的经验方，由大黄、黄连、黄柏、绵马贯众、威灵仙、白芷等组成，主要起消肿止痛、软坚散结、化石通管、益肺健脾健肾、利水祛毒作用，在羌族地区有上百年的用药史，临床疗效明确。文献报道，中药黄连、黄柏在体外可以显著抑制黄嘌呤氧化酶的活性[5-7]，小檗碱是黄连、黄柏中主要的有效成分，具有抗尿酸、治疗痛风的作用[8-9]。本实验采用 TLC 法鉴别刷格痛风膏中的黄连、大黄、黄柏，并采用HPLC进行含量测定，进行质量标准评价研究，旨在为刷格痛风膏的推广应用提供参考依据。本研究中对方中主要药味进行了定性、定量研究，可为质量标准的制订和临床安全用药提供参考，进一步推动刷格痛风膏的发展和应用。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters 2695 高效液相色谱仪(Waters公司)；Inertsil ODS-3色谱柱(4.6 mm×250 mm Column，5 μm)(Waters公司)；METTLER TOLEPO ME55电子天平(梅特斯-托利多仪器(上海)有限公司)；KQ-300DE型数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；HWS-12型电热恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司)；LabServ®10-100 μL移液枪(上海臻诺生物科技有限公司)。

1.2 试药 黄连对照药材(批号20032705，成都康邦生物科技有限公司)；大黄对照药材(批号20060703，成都康邦生物科技有限公司)；绵马贯众对照药材(批号20081003，成都康邦生物科技有限公司)；盐酸小檗碱对照品(批号20051903，HPLC>98%，成都康邦生物科技有限公司)；屈臣氏水(广州屈臣氏食品饮料有限公司)；色谱级甲醇、乙腈(北京迪科马科技有限公司)；色谱级磷酸(天津市科密欧化学试剂有限公司)；分析纯盐酸(天津市科密欧化学试剂有限公司)；薄层色谱硅胶G板(批号20170902，青岛海洋化工厂)。

2 方法与结果

2.1 薄层鉴别

2.1.1 黄连 选3个批次的刷格痛风膏，除去裱褙材料，分别称取膏体2.5 g,剪成小块，加甲醇25 mL，超声处理30 min滤过，滤液浓缩至10 mL作为供试品溶液；另取不含黄连的刷格痛风膏阴性对照品2.5 g，照供试品溶液制备方法制成缺黄连的阴性对照溶液；称取黄连对照药材0.25 g,同供试品溶液制备方法制成对照药材溶液。吸取上述3种溶液，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶6∶2∶2)为展开剂，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应的位置上，显3个相同颜色的荧光斑点，且阴性对照无干扰。结果如图1所示。

1～3.供试品；4.阴性对照；5.黄连对照药材图1 黄连薄层色谱检识图

2.1.2 大黄 选3个批次的刷格痛风膏，除去背衬层和覆盖物，分别称取膏体3 g，剪成小块，加甲醇25 mL，超声处理1 h，滤过，将滤液浓缩至1 mL，作为供试品溶液。另取不含大黄的膏体3 g，照供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。另取大黄对照药材0.1 g，同法制成对照药材溶液。吸取上述3种溶液，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯-冰醋酸(15∶5∶0.3)为展开剂，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显示相同颜色的荧光斑点，且阴性对照无干扰。结果如图2所示。

2.1.3 黄柏 选3个批次的刷格痛风膏，除去背衬层和覆盖物，分别称取膏体3 g，剪成小块，加25 mL甲醇超声1 h，滤液蒸干，加1 mL甲醇溶解，作为供试品溶液。称取不含黄柏的膏体3 g，同法制成阴性对照溶液。称取黄柏对照药材0.5 g，同法制成对照药材溶液。称取10 mg盐酸黄柏碱对照品，置100 mL容量瓶中定容至刻度，得到0.1 mg/mL的盐酸黄柏碱对照品溶液。取供试品溶液、阴性对照溶液和对照药材溶液各6 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶6∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液，置日光灯下观察。供试品色谱中，在与对照药材相应的位置上，显相同颜色的主斑点，且阴性对照无干扰。结果如图3所示。

1～3.供试品；4.阴性对照； 1～3.供试品；4.阴性对照； 5.大黄对照药材 5.黄柏对照药材；6.盐酸黄柏碱对照品图2 大黄薄层色谱检识图 图3 黄柏薄层色谱检识图

A.盐酸小檗碱对照品;B.盐酸小檗碱阴性对照品;C.供试品图4 HPLC色谱图

2.2 盐酸小檗碱的含量测定

2.2.1 色谱条件 Inertsil ODS-3色谱柱(4.6 mm×250 mm Column，5 μm)；以乙腈-0.1%磷酸水溶液(28∶72)为流动相进行等度洗脱，柱温25 ℃，流速1 mL/min，进样量2 μL，检测波长265 nm。

2.2.2 对照品储备液的制备 精密称取盐酸小檗碱标准品10 mg，置于100 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，制成每1毫升含0.1 mg盐酸小檗碱的对照品储备溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 精密称取膏体2.5 g,置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-盐酸(100∶1)的混合溶液25 mL，密塞，称定重量，超声处理(功率100 W，频率40kHz)30 min，放冷，再称定重量，用甲醇-盐酸(100∶1)的混合溶液补足减失的重量，摇匀，用 0.22 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.4 阴性对照溶液的制备 精密称取不含盐酸小檗碱的阴性对照样品，按供试品溶液的制备方法制成的阴性对照溶液。

2.2.5 专属性试验 分别精密吸取上述3种溶液各 2 μL，注入液相色谱仪，记录 HPLC色谱图，结果盐酸小檗碱阴性对照与盐酸小檗碱对照品色谱峰相应位置上无干扰。如图4所示。

2.2.6 线性关系考察 精密称取盐酸小檗碱对照品10 mg于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，得到1 mg/mL的盐酸小檗碱对照品溶液。分别精密吸取盐酸小檗碱对照品溶液500、200、100、80、50、20 μL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到0.05、0.02、0.01、0.008、0.005、0.002 mg/mL不同浓度的对照品溶液。分别精密吸取各对照品溶液2 μL，按“2.2.1”项下的色谱条件进样，绘制标准曲线，得到盐酸小檗碱的回归方程y=55900278.40x-27861.07，r=0.9998，结果见图5。结果表明，盐酸小檗碱在0.004～0.1 μg 范围内，其进样量与峰面积呈良好的线性关系。

图5 标准曲线图

2.2.7 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液，按上述色谱条件连续进样 6 次，盐酸小檗碱峰面积的RSD为0.30%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.2.8 重复性试验 取同一批样品 6 份，按 “2.2.4”项下方法制备6份供试品溶液，按上述色谱条件进样测定，测得盐酸小檗碱的平均含量为 0.26 mg/g，RSD 为 1.74%(n=6)，表明方法重复性良好。

2.2.9 稳定性试验 取同一供试品溶液分别于制备后0、2、4、8、16、24 h按上述色谱条件进样测定，测得盐酸小檗碱峰面积的RSD为1.74%，表明刷格痛风膏供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.10 加样回收试验 精密称取6份已知含量的样品适量，分别精密加入对照品，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积，计算加样回收率。结果见表1。结果6份刷格痛风膏中盐酸小檗碱的平均加样回收率为99.45%，RSD为1.70%(n=6)。

2.2.11 含量测定 精密称取6份样品，按“2.2.4”项下制备供试品溶液，进样测定，以外标法计算盐酸小檗碱的含量。结果见表2。

表1 刷格通风膏加样回收率试验测定结果 (n=6)

表2 刷格痛风膏中盐酸小檗碱含量测定结果 (n=6)

3 讨论

刷格痛风膏为传统膏药剂型，具有组成复杂、主药含量少和基质难于去除的特点，基质与待测成分分离是刷格痛风膏含量测定的关键。因此，本研究依据文献报道[10-12]并结合本制剂的特点，在制备供试品溶液时，考察了不同提取溶剂(甲醇、50%甲醇、60%乙醇、甲醇-盐酸(100∶1))、不同提取方法(超声、回流)、不同提取时间(30 h、1 h、1.5 h、2 h)、不同料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50)对盐酸小檗碱含量测定的影响。结果发现用甲醇-盐酸(100∶1)超声30 min，料液比为1∶10时提取率最高。因此，采用该方法作为盐酸小檗碱含量测定的供试品溶液制备方法。本研究在参考相关文献的基础上，还考察了不同的色谱条件对刷格痛风膏中盐酸小檗碱含量的影响，最终确定了柱温为25 ℃，检测波长为265 nm，流动相比例为乙腈-0.1 %磷酸水溶液(28∶72)的HPLC色谱条件。通过以上实验结果表明:以大黄、黄连、黄柏薄层色谱鉴别和盐酸小檗碱含量测定方法准确、可靠，可以作为刷格痛风膏的质量控制方法。