息风定喘方对哮喘豚鼠血清VEGF、EGF、TGF-β2 的调节作用

郭思彤 尚莉丽

1.安徽中医药大学研究生院，安徽合肥 230038；2.安徽中医药大学第一附属医院儿科，安徽合肥 230031

支气管哮喘是小儿时期易患的呼吸系统疾病，发病原因与多种细胞参与的气道慢性炎症相关，迁延不愈则易损伤患儿心肺功能[1]。按照2019 年全球哮喘防治创议方案，控制儿童哮喘症状和降低未来发作风险的首选药物仍是糖皮质激素[2]。但有研究[3]表明约有20%的患儿哮喘并未得到控制。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、转化生长因子β2（transforming growth factor β2，TGF-β2）是气道慢性炎症发作的重要因素。本课题组动物实验研究经验丰富[4-6]，本实验通过建立哮喘豚鼠干预模型，观察息风定喘方对模型豚鼠肺组织病理改变及对VEGF、EGF、TGF-β2 的影响，研究其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

72 只3～4 周龄体重（165±15）g 普通级的雄性豚鼠。由南京市浦口区莱芙养殖场提供[合格证号：NO.202 009237；许可证号：SCXX（苏）2019-0005]。饲养于动物实验中心，室内温度（23±2）℃，相对湿度50%～70%。动物伦理批准编号：AHUCM-guinea pigs-2020007）。

1.2 药物

息风定喘方颗粒剂（由安徽中医药大学第一附属医院提供，广东一方制药有限公司生产，批号：粤20160214），药物组成：以小青龙汤为基础加用僵蚕、地龙、全蝎。地塞米松片：0.75 mg/片（上海上药信宜药厂有限公司，批号：H31020793）。鸡卵清蛋白（美国Sigma 公司，批号：A5253）。

1.3 试剂与仪器

VEGF、EGF、TGF-β2 试剂盒（Abcam 公司，批号：GR2021-01）。402AI 医用超声雾化吸入器（广东粤华医疗器械厂有限公司，型号：WH-2000）；低温冷冻离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司，型号：TG-16M）；酶标仪（芬兰雷勃酶标仪，型号：MK3）；恒温水浴锅（Leica，型号：HI1210）；正置显微镜（NIKON 公司，型号：ECLIPSE Ni）。

1.4 研究方法

1.4.1 动物分组 将72 只幼龄雄性豚鼠按照随机数字表法分为正常对照组，寒哮模型组，息风定喘方高、中、低剂量组及地塞米松组，每组12 只。

1.4.2 模型制备 依据中医寒哮动物模型建立方法[7-9]，适应性饲养1 周后，分别于第8、15 天进行腹腔注射，造模各组注射10%卵清蛋白和氢氧化铝混合溶液1 ml 致敏，正常对照组注射等剂量生理盐水。第2 次腹腔注射致敏1 周后，造模各组用1%卵清蛋白溶液雾化激发哮喘，30 min/次，1 次/d，持续1 周，每次结束后将其放置于0～4℃的恒温箱内给予寒冷刺激1 h；正常对照组雾化用等剂量生理盐水代替。当豚鼠逐渐出现咳嗽、呼吸急促、烦躁不安等哮喘症状，同时有畏寒、颤抖、喷嚏、流涕等现象[10]，提示寒性哮喘模型造模成功。

1.4.3 给药方法 造模成功后，实验第29 天，参考《药理实验方法学》[11]，按人与豚鼠体表面积换算公式计算给药剂量。息风定喘方高、中、低剂量组分别予息风定喘方颗粒剂22.72、11.36、5.68 g/（kg·d）（剂量均为每袋颗粒剂所含的中药生药量）。地塞米松组予0.75 mg/片规格的地塞米松0.05 mg/（kg·d）。正常对照组和寒哮模型组予生理盐水10 ml/（kg·d）。每天固定时间段灌胃1 次，连续21 d。

1.4.4 血清VEGF、EGF 及TGF-β2 水平测定 末次给药后予禁食24 h，造模各组最后以1%卵蛋白溶液雾化激发后取材。考虑每组均有不同原因致死（2～4 只）情况发生，每组取8 只进行实验取材。以浓度20%的乌拉坦（1.5 g/kg）腹腔注射麻醉并完成5 ml 腹主动脉采血，离心15 min（4℃，离心半径8.4 cm，速率3500 r/min），分离血清。采用酶联免疫法检测血清中VEGF、EGF及TGF-β2 水平。按照相关试剂盒提供方法操作。

1.4.5 肺组织病理变化观察 腹主动脉采血完成后，立即取出肺组织，固定2～3 d 后依次进行脱水、包埋，切片成4～7 μm 的厚度，HE 染色后，光镜下观察豚鼠肺组织的病理改变。

1.5 统计学方法

采用SPSS 23.0 软件对所得数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD-t 检验，两组间比较采用t 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

参与哮喘造模的各组豚鼠在激发阶段，逐渐出现搔鼻、喷嚏，频繁抓耳挠腮等典型哮喘症状。药物干预后，豚鼠喷嚏及咳嗽症状改善，食量增加、体重增长速度增快，被毛光泽恢复，其中息风定喘方高剂量组豚鼠症状改善情况优于息风定喘方中、低剂量组。

2.2 各组肺组织病理情况

正常对照组的肺组织整体结构正常，无明显炎症细胞浸润。寒哮模型组肺泡间隔增厚增宽，肺泡腔内可见大量炎症细胞浸润，杯状细胞增生，气道腔黏液增多。与寒哮模型组比较，息风定喘方各剂量组气道改变均有减轻，有不同程度炎症细胞浸润，肺泡间隔厚度降低。见图1。

图1 各组豚鼠肺组织病理变化（HE，200×）

2.3 各组血清VEGF、EGF、TGF-β2 含量比较

与正常对照组比较，寒哮模型组血清中VEGF、EGF、TGF-β2 含量升高，差异均有高度统计学意义（P ＜0.01）。与寒哮模型组比较，息风定喘方各剂量组的VEGF、EGF、TGF-β2 含量均降低，差异有统计学意义（P ＜0.05）。息风定喘方低、中剂量组血清VEGF 含量均高于息风定喘方高剂量组，差异均有统计学意义（P ＜0.05）；息风定喘方中、低剂量组血清VEGF 含量比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。息风定喘方低剂量组血清EGF 含量高于息风定喘方高、中剂量组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。息风定喘方高剂量组与息风定喘方中剂量组血清EGF 含量比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。息风定喘方低剂量组血清TGFβ2 含量高于息风定喘方高、中剂量组，息风定喘方中剂量组血清TGF-β2 含量高于息风定喘方高剂量组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表1。

表1 各组血清VEGF、EGF、TGF-β2 含量比较（pg/ml，）

表1 各组血清VEGF、EGF、TGF-β2 含量比较（pg/ml，）

注：与正常对照组比较，aaP ＜0.01；与寒哮模型组比较，bP ＜0.05；与息风定喘方高剂量组比较，cP ＜0.05；与息风定喘方中剂量组比较，dP ＜0.05。VEGF：血管内皮生长因子；EGF：表皮生长因子；TGF-β2：转化生长因子β2

3 讨论

中医学认为哮喘发作时主要病机为“风痰阻肺”[12]，寒性哮喘则是发病时具有气喘咳嗽、喉间哮鸣、痰稀色白、形寒肢冷等一系列证候的病证[13]。息风定喘方是尚莉丽教授依据“内风”[14-15]理论，从“伏邪”[16]角度，以治疗寒性哮喘之经方小青龙汤为主方，加僵蚕、地龙、全蝎三味虫类药组成的自拟方，已长期应用于临床，并取得很好的疗效。虫类药物因其性擅走窜、可入络搜风、息风止痉[17]，可使肺气宣降得宜、内风得息、气道挛急得以缓解。现代药理学研究也证实僵蚕、地龙、全蝎等虫类药有缓解支气管痉挛，降低气道高反应性等作用[18-20]。

VEGF 作为刺激血管生成的重要信号蛋白[21]，可使炎症细胞从循环系统向炎症部位迁移，帮助炎症的发展和持续[22]。EGF 则可刺激表皮细胞等的增殖[23]，气道组织中EGF 可在异常刺激下与高分泌的肝素结合，介导气道重塑过程[24]。TGF-β 是支气管哮喘发作时影响气道重塑的重要介质，其可以促进上皮纤维化、杯状细胞和平滑肌增生[25]。

本研究结果显示，息风定喘方对寒性哮喘豚鼠有一定的治疗作用，其可能机制是通过调节VEGF、EGF、TGF-β2 水平达到降低炎症因子含量，抑制细胞增殖，控制气道炎症，改善气道重塑的目的，从而产生疗效。