薜荔果多酚的超声辅助法提取工艺优化及抗氧化性研究

黄秋萍，曾振芳，韦友欢，黄秋婵，罗丽园，郑燕菲

(广西民族师范学院 化学与生物工程学院，广西 崇左 532200)

薜荔(FicuspumilaL.)又名凉粉子、凉粉树、木莲等，属桑科榕属植物，常绿攀援或匍匐灌木，耐贫瘠且抗干旱，适应性强，野生资源丰富且极易种植，主要分布在我国中部和南部[1]，是具有开发价值的天然植物资源。薜荔的藤、叶为药用部分，具有解毒消肿、活血通络、祛风除湿等功效[2]。薜荔的果实可加工食用，如制成凉粉、加工成果冻等，是纯天然的绿色食品。目前，关于薜荔果有效成分的研究主要集中于薜荔籽多糖的提取及生物活性的研究[3-6]。薜荔籽果胶具有调节血糖、血脂及提高肠道有益菌比例等药理作用[7]；薜荔果实中的多糖提取液还具有提高免疫功能及改善肠道环境等效果[8]，但对薜荔果实中多酚的提取及应用研究未见报道。

多酚是植物生长中重要的次生代谢产物，多酚类化合物广泛存在于植物的茎、叶、根及果实中。植物多酚不仅表现出良好的抗氧化活性[9]，还具有抑菌、抗炎、防治心血管疾病、防癌抗癌及抑制肿瘤等药理活性[10-12]，其开发与应用已经成为食品和医药领域的研究热点之一，而不同植物或同一植物中不同部位所含多酚的量及其抗氧化活性存在一定的差异。采用超声波辅助法提取薜荔果中的多酚，通过单因素试验和正交试验设计优化薜荔果多酚的提取工艺条件，并通过薜荔果多酚对DPPH·及·OH的清除效果，考察薜荔果中多酚的抗氧化活性，为薜荔植物多酚的深入研究及进一步开发应用于食品保健和药品等领域提供了依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

薜荔果：2020年7月采摘于广西崇左市石景林景区，洗净，恒温60 ℃烘干，粉碎(60目筛)备用。

单宁酸(纯度≥99%)、福林酚、丙酮、DPPH等试验试剂：均为分析纯。

FW100型高速万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；722型可见分光光度计 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；SG2200HPT型超声波清洗仪 上海冠特超声仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 标准曲线的绘制

参考文献[13]的方法，配制不同浓度梯度的单宁酸标准溶液，采用福林酚显色法显色后分别测定它们在760 nm处的吸光度，绘制标准曲线，拟合得回归方程：y=93.7804x+0.0796，R2=0.9990，其中x为单宁酸溶液的质量浓度，y为对应的吸光度值。

1.2.2 薜荔果多酚的提取

称取一定量已粉碎过60目筛的薜荔果粉末，用石油醚以1∶4(g/mL)的料液比在70 ℃的油浴条件下回流4 h完成脱脂、除色处理，再放置于60 ℃恒温箱中干燥，即得脱脂脱色的薜荔果粉末原料。称取已脱脂脱色的1.0000 g薜荔果粉末原料，加入定量丙酮溶液，于特定条件下超声辅助提取，过滤，滤液定容至100 mL容量瓶中，避光保存备用。

1.2.3 薜荔果多酚的定性分析

量取5 mL的薜荔果多酚提取液和单宁酸标液，分别加入少量的0.3% FeCl3、1%明胶溶液，摇匀，观察试验现象；依次将1 mL 36%甲醛和2 mL浓盐酸加入至10 mL薜荔果多酚提取液中，煮沸后回流30 min，以单宁酸为对照组，观察试验现象；取薜荔果多酚提取液0.1 mL进行福林酚显色，用紫外分光光度计扫描，以单宁酸作为对照。

1.2.4 薜荔果多酚得率的测定

按照1.2.1的福林酚显色法显色后测定提取液在760 nm处的吸光度，用标准曲线方程计算相关浓度，根据下式计算薜荔果多酚的得率：

式中：Y为薜荔果多酚的得率，%；WR为脱脂原料的质量，g；C为通过标准曲线方程求出的浓度，mg/mL；V1为提取液的总体积，mL；V2为测定时量取的提取液体积，mL。

1.2.5 薜荔果多酚提取的单因素试验

1.2.5.1 丙酮体积分数

固定料液比1∶20(g/mL)，提取温度50 ℃，提取时间20 min，分别测定提取剂为30%、40%、50%、60%、70%时对应的薜荔果多酚得率，确定合适的提取剂丙酮的体积分数。

1.2.5.2 料液比

固定50%丙酮为提取剂，提取温度50 ℃，提取时间20 min，分别测定料液比为1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40(g/mL)的对应的薜荔果多酚的得率，确定合适的料液比。

1.2.5.3 提取温度

固定50%丙酮为提取剂，料液比1∶30(g/mL)，提取时间20 min，分别测定提取温度为50，60，70，80，90 ℃时对应的薜荔果多酚的得率，确定合适的提取温度。

1.2.5.4 提取时间

固定50%丙酮为提取剂，料液比1∶30(g/mL)，提取温度60 ℃，分别测定提取时间为80，100，120，140，160 min时对应的薜荔果多酚的得率，确定合适的提取时间。

1.2.6 正交试验设计

以单因素试验结果为依据，以丙酮体积分数(%)、料液比(g/mL)、提取温度(℃)及时间(min)为4个考察因素进行L9(34)正交试验设计，见表1。

表1 正交试验因素水平 Table 1 Orthogonal experimental factors and levels

1.2.7 薜荔果多酚抗氧化性的测定

以抗坏血酸为阳性对照，分别参照文献[14-15]的方法测定最佳工艺条件下提取得到的薜荔果多酚对DPPH·及·OH的清除效果，以对应清除率为参考指标评价薜荔果中多酚的抗氧化活性。

1.3 数据处理

所有试验数据平行测定3次，取平均值，采用Origin 8.5软件进行数据处理和图片绘制。

2 结果和分析

2.1 薜荔果多酚的定性分析结果

2.1.1 颜色反应对比

以单宁酸溶液作对比，用薜荔果多酚提取液的颜色反应进行定性分析，结果见表2。

表2 定性分析试验结果Table 2 The experimental results of qualitative analysis

由表2可知，薜荔果提取液中含有多酚类物质——单宁。

2.1.2 紫外可见光谱对比

经福林酚显色后的薜荔果多酚提取液和单宁酸标准液的紫外可见光谱见图1。

图1 薜荔果多酚的紫外可见光谱图Fig.1 UV-vis spectra of polyphenols from Ficus pumila Linn.

由图1可知，薜荔果多酚提取液和单宁酸标准液均在760 nm处出现最大吸收峰，故选择760 nm作为测定的吸收波长。

2.2 单因素试验结果

由图2可知，薜荔果多酚的得率随着丙酮体积分数的增大先升高后降低。当丙酮体积分数为50%时对应得率最大，为3.58%，继续增大丙酮体积分数，脂溶性物质溶出增多，使得多酚的得率下降。因此，选取的最佳丙酮体积分数为50%。随着料液比浓度的增大，薜荔果多酚得率呈先升高后降低的趋势，在1∶30 (g/mL)料液比时对应的多酚得率最大，为4.45%，再继续增大料液比则其他杂质溶出也增多，从而导致多酚得率下降[16]，且不利于后续浓缩处理。因此，选取的最佳料液比为1∶30(g/mL)。随着提取温度由30 ℃升高至40 ℃时，对应的薜荔果多酚得率显著增加，但提取温度范围在40～60 ℃时多酚得率基本维持不变，而提取温度高于60 ℃则多酚得率显著降低。原因是低温不利于酚类物质的溶出，但温度较高会使部分多酚氧化和降解，导致多酚得率降低[17]。因此，选取的最佳提取温度为60 ℃。薜荔果多酚得率随着提取时间的增加先升后降，提取时间过长则部分多酚物质被氧化出现耗损也会被分解导致结构被破坏，导致其得率降低[18]。因此，选取的最佳提取时间为120 min。

2.3 正交试验结果

以单因素试验结果为基准，按表1的因素水平进行L9(34)正交试验，优化薜荔果多酚提取工艺，确定最佳提取工艺条件，试验结果见表3。

表3 薜荔果多酚提取正交试验结果Table 3 The orthogonal experimental results of the extraction of polyphenols from Ficus pumila Linn.

由表3的正交试验结果可知，对薜荔果多酚得率的影响因素顺序为：提取时间(D)>提取温度(C)>丙酮体积分数(A)>料液比(B)。因此，其最佳提取工艺条件为A1B3C3D3，即丙酮体积分数40%、料液比1∶35(g/mL)、提取温度70 ℃及提取时间150 min。按上述的最佳提取工艺条件进行3次平行试验，对应得到总黄酮的得率分别为4.60%、4.54%、4.62%，均值为4.59%，高于正交试验表中的最高得率4.44%，且RSD值小于5%，说明此试验所得结果稳定且重现性较好。

2.4 薜荔果多酚的抗氧化性结果

2.4.1 薜荔果多酚清除DPPH·的能力

由图3可知，随着浓度的不断增大，薜荔果多酚提取液对DPPH·的清除能力也逐渐增强，其清除能力与多酚提取液浓度呈正相关。薜荔果多酚浓度为0.05 mg/mL时，其对DPPH·的清除率为86.9%(相同浓度下Vc对DPPH·的清除率为97.1%)，IC50值是0.026 mg/mL，表明薜荔果多酚对DPPH·具有良好的清除能力，但是弱于Vc。

图3 薜荔果多酚对DPPH·的清除效果Fig.3 Scavenging effect of polyphenols from Ficus pumila Linn. on DPPH·

2.4.2 薜荔果多酚清除·OH的能力

由图4可知，薜荔果多酚对·OH的清除效果随着其浓度增大而显著增强，清除效果与浓度呈正相关。在薜荔果多酚浓度为0.9 mg/mL时，它对·OH的清除率达64.7%，低于同浓度下Vc对·OH的清除率86.5%，薜荔果多酚对应的IC50值为0.72 mg/mL，表明薜荔果多酚具有一定的抗氧化性。

图4 薜荔果多酚对·OH的清除效果Fig.4 Scavenging effect of polyphenols from Ficus pumila Linn.on ·OH

3 结论

通过单因素试验和正交试验设计优化超声波辅助法提取薜荔果多酚的工艺，得到最佳提取工艺条件为：丙酮40%、料液比1∶35(g/mL)、提取温度70 ℃及提取时间150 min，该条件下薜荔果多酚提取率为4.59%。薜荔果多酚对DPPH自由基的清除效果较显著且具有清除羟自由基的能力，在试验浓度范围内对DPPH·和·OH的最大清除率分别为86.9%、64.7%，对应的IC50值分别是0.026，0.72 mg/mL。薜荔果多酚清除自由基的能力与浓度呈正相关的量效关系，表明薜荔果多酚具有良好的抗氧化活性，可作为天然抗氧化剂应用于食品、药品等行业。后续可对薜荔植物不同部分中的多酚进行提取并对有效成分做进一步的分离纯化和鉴定，深入分析多酚各组分对抗氧化性的贡献，构筑薜荔植物中多酚的抗氧化活性与各有效成分之间的量效关系，为研究开发薜荔植物并作为天然抗氧化剂应用于食品、药品领域提供了依据。