HPLC-DAD-ELSD法同时测定养心氏片中11个成分的含量

2022-04-13蔡睿婧黎璟

食品与药品 2022年2期

蔡睿婧，陆黎璟

（南京市中医院药剂科，江苏南京 210000）

养心氏片源于著名中医周次清的临床经验方，现收载于《中华人民共和国药典》2020版一部，是由黄芪、人参、淫羊霍、党参、丹参、葛根、山楂、地黄、当归、黄连、醋延胡索、灵芝和炙甘草组成的复方制剂。养心氏片具有扶正固本，益气活血，行脉止痛的功效，用于气虚血瘀型冠心病、心绞痛、心肌梗塞及合并高血脂、高血糖等症见有上述证候者，是治疗气虚血瘀所致胸痹心痛的有效药物[1]。有研究发现养心氏片可通过升高血清和海马中5-羟色胺（5-HT）、去甲肾上腺素（NA）、多巴胺（DA）的水平，改善和缓解慢性不可预知的刺激性抑郁及缺血再灌注诱导的血管性抑郁症状[2]。

现行质量标准仅以黄芪中的黄芪甲苷为定量指标评价养心氏片，指标较为单一，未对主药人参、丹参、葛根等其他成分进行定量控制，无法完整准确地反映中药制剂的复杂性和多样性，且养心氏片具有“多成分-多靶点-多途径”的特点，因此建立符合中药配伍理论，能有效检测多成分含量的质量控制方法是有必要的。已有文献报道采用高效液相色谱（HPLC）法测定养心氏片中葛根素、大豆苷、丹参素、芦丁、延胡索乙素、淫羊藿苷、芹菜素、人参皂苷Rd、阿魏酸的含量[3-4]，君药人参中的皂苷类成分的含量测定尚未报道。本研究采用高效液相色谱-二极管阵列检测-蒸发光散射检测（HPLC-DAD-ELSD）串联法，同时测定黄芪中黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷，人参中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1，丹参中丹酚酸B，淫羊藿中淫羊藿苷，葛根中葛根素，黄连中盐酸小檗碱，当归中阿魏酸，延胡索中延胡索乙素11个指标性成分，从而更加全面地控制养心氏片的质量，为该制剂的质量评价和作用机制研究提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

赛默飞DIONEX Ultimate 3000高效液相色谱仪（包括四元高压溶剂梯度泵、自动进样器、Chromeleon©Dionex色谱工作站、Alltech 3300 蒸发光散射检测器、二极管阵列检测器）；ABS-135S型电子天平（d=0.01 mg，瑞士梅特勒公司）；KQ-500E型数据超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

对照品：毛蕊异黄酮葡萄糖苷（批号：111920-201606，含量：97.6 %），黄芪甲苷（批号：110781-201717，含量：96.9 %），葛根素（批号：110752-201816，含量：95.4 %），盐酸小檗碱（批号：110713-202015，含量：85.9 %），阿魏酸（批号：110773-201614，含量：99.0 %），丹酚酸B（批号：111562-201917，含量：96.6 %），淫羊藿苷（批号：110737-202017，含量：98.1 %），延胡索乙素（批号：110726-201819，含量：99.8 %），人参皂苷Rg1（批号：110703-201933，含量：93.4 %），人参皂苷Re（批号：110754-202028，含量：93.9 %），人参皂苷Rb1（批号：110704-202028，含量：93.1 %），均购自中国食品药品检定研究院；养心氏片11批（S1～S11，批号分别为181021，190311，190404，190417，190723，190811，191102，191224，200314，200415，200409，上海医药集团青岛国风药业股份有限公司，规格为0.3 g/片）；甲醇、乙腈均为色谱纯（德国默克公司），其他试剂均为分析纯，水为超纯水（自制）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters Sunfire C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.1 %甲酸水溶液，梯度洗脱（0～5 min，8 %A；5～10 min，8 %→20 %A；10～15 min，20 %→35 %A；15～25 min，35 %→65 %A；25～40 min，65 %A；40～45 min，65 %→80 %A；45～50 min，80 %→8 %A）；流速为1.0 ml/min；DAD检测波长：254 nm（检测葛根素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷），278 nm（检测延胡索乙素、丹酚酸B、淫羊藿苷），316 nm（检测阿魏酸），345 nm（检测盐酸小檗碱）；黄芪甲苷、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1使用ELSD检测器：漂移管温度110 ℃，气体流量2.5 L/min；柱温30 ℃；进样量10 μl。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液精密称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷、延胡索乙素、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1对照品适量，置50 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制得浓度分别为0.528，0.148，0.372，1.476，0.536 mg/ml的对照品储备溶液，备用。精密称取黄芪甲苷、阿魏酸、淫羊藿苷对照品适量，置5 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制得浓度分别为4.976，2.244，2.460 mg/ml的对照品储备溶液，备用。精密称取葛根素、盐酸小檗碱、丹酚酸B对照品适量，置100 ml量瓶中，分别加入上述两种对照品储备液各1 ml，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取上述溶液5 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇，制成每1 ml分别含毛蕊异黄酮葡萄糖苷2.64 μg、黄芪甲苷24.88 μg、葛根素45.06μg、盐酸小檗碱109.42 μg、阿魏酸11.22 μg、丹酚酸B 122.82 μg、淫羊藿苷12.30 μg、延胡索乙素0.74 μg、人参皂苷Rg11.86 μg、人参皂苷Re 7.38 μg、人参皂苷Rb12.68 μg的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液取本品20片，除去包衣，置研钵中研细，精密称取细粉约1.0 g，置具塞稚形瓶中，精密加入70 %甲醇溶液25 ml，密塞，称定重量，超声（500 W，40 kHz）40 min，取出放冷，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，取续滤液5 ml，置10 ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液按养心氏片处方比例，分别制备缺黄芪、缺人参、缺淫羊霍、缺丹参、缺葛根、缺当归、缺黄连、缺醋延胡索的阴性对照样品，按2.2.2项方法制备，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 系统适用性试验及专属性试验分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μl，按2.1项色谱条件测定，记录色谱图。结果，理论塔板数按阿魏酸色谱峰计大于8000；毛蕊异黄酮葡萄糖苷、黄芪甲苷、葛根素、盐酸小檗碱、阿魏酸、丹酚酸B、淫羊藿苷、延胡索乙素、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1色谱峰与相邻色谱峰之间的分离度均大于1.5，对称因子在0.95～1.38之间；各阴性样品溶液色谱图在相应待测组分保留时间处未见色谱峰，说明其他成分对测定结果无干扰，表明该方法专属性良好。色谱图见图1、图2。

图1 养心氏片HPLC-DAD色谱图

图2 养心氏片HPLC-ELSD色谱图

2.3.2 线性关系考察精密量取混合对照品溶液2，4，8，12，16，20 ml，分别置25 ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，按2.1项色谱条件依次进样，记录色谱图。以各对照品质量浓度（X，mg/ml）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制毛蕊异黄酮葡萄糖苷、葛根素、盐酸小檗碱、阿魏酸、丹酚酸B、淫羊藿苷、延胡索乙素回归曲线，计算回归方程及相关系数；以对照品质量浓度的对数值（X）为横坐标，峰面积的对数值（Y）为纵坐标，绘制黄芪甲苷、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的回归曲线，计算回归方程及相关系数，结果见表1。结果表明，各待测组分在试验范围内线性关系良好。

表1 11个有效成分的回归方程及线性范围

2.3.3 精密度试验取每1 ml含毛蕊异黄酮葡萄糖苷2.64 μg、黄芪甲苷24.88 μg、葛根素45.06 μg、盐酸小檗碱109.42 μg、阿魏酸11.22 μg、丹酚酸B 122.82 μg、淫羊藿苷12.30 μg、延胡索乙素0.74 μg、人参皂苷Rg11.86 μg、人参皂苷Re 7.38 μg、人参皂苷Rb12.68 μg的混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图及各组成色谱峰峰面积。结果毛蕊异黄酮葡萄糖苷、黄芪甲苷、葛根素、盐酸小檗碱、阿魏酸、丹酚酸B、淫羊藿苷、延胡索乙素、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1峰面积RSD分别为1.23 %，1.09 %，1.22 %，0.47 %，1.03 %，1.57 %，0.72 %，1.34 %，1.26 %，1.14 %，0.84 %（n=6），表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性试验取养心氏片供试品（批号：181021），按2.2.2项方法处理后0，4，8，12，16，20，24 h，按2.1项色谱条件测定，记录色谱图及各色谱峰峰面积。结果毛蕊异黄酮葡萄糖苷、黄芪甲苷、葛根素、盐酸小檗碱、阿魏酸、丹酚酸B、淫羊藿苷、延胡索乙素、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1峰面积RSD分别为1.19 %，1.31 %，1.77 %，1.56 %，1.92 %，0.62 %，1.34 %，0.81 %，0.42 %，1.52 %，0.71 %（n=7），表明供试品溶液24 h内稳定性良好。

2.3.5 重复性试验取养心氏片供试品（批号：181021）6份，分别按2.2.2项方法处理，按2.1项色谱条件分析，记录色谱图及各色谱峰峰面积。结果毛蕊异黄酮葡萄糖苷、黄芪甲苷、葛根素、盐酸小檗碱、阿魏酸、丹酚酸B、淫羊藿苷、延胡索乙素、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1平均含量分别为0.115，1.257，2.269，5.422，0.595，6.133，0.609，0.031，0.089，0.371，0.126 mg/g，RSD分别1.22 %，0.79 %，1.36 %，0.94 %，1.18 %，1.90 %，0.37 %，1.54 %，1.87 %，1.36 %，1.43 %（n=6），表明方法重复性良好。

2.3.6 加样回收试验取已知含量的养心氏片供试品（批号：181021）9份，每份约0.5 g，精密称定，分成3组，分别精密加入含毛蕊异黄酮葡萄糖苷0.023 mg/ml、黄芪甲苷0.252 mg/ml、葛根素0.455 mg/ml、盐酸小檗碱1.088 mg/ml、阿魏酸0.119 mg/ml、丹酚酸B 1.231 mg/ml、淫羊藿苷0.122 mg/ml、延胡索乙素0.006 mg/ml、人参皂苷Rg10.018 mg/ml、人参皂苷Re 0.074 mg/ml、人参皂苷Rb10.025 mg/ml的混合对照品溶液3.0，2.5，2.0 ml，按2.2.2项方法处理，按2.1项色谱条件分析。结果毛蕊异黄酮葡萄糖苷、黄芪甲苷、葛根素、盐酸小檗碱、阿魏酸、丹酚酸B、淫羊藿苷、延胡索乙素、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1平均加样回收率分别为101.8 %，96.4 %，99.0 %，103.4 %，102.7 %，95.1 %，108.5 %，100.9 %，101.7 %，99.9 %，103.6 %，RSD分别为1.09 %，0.82 %，1.33 %，2.25 %，1.13 %，1.84 % ，0.58 %，2.10 %，1.56 % ，1.82 %，1.11 %（n=9），具体数据见表2。结果表明，该方法准确度良好。

表2 （续）

表2 加样回收试验结果

2.4 样品含量测定

取11批养心氏片供试品，按2.2.2项方法处理，按2.1项色谱条件测定，记录色谱图及各色谱峰峰面积，按外标法计算各组分含量，结果见表3。

表3 养心氏片11个成分含量测定结果（n=3）

3 讨论

3.1 质量评价指标的确定

养心氏片方中黄芪、人参为君药，主大补元气、安神定志、补气生血、健脾养心[5-6]；党参、灵芝、葛根、当归主健脾益气、生津养血、化痰通脉、安神定悸[7-10]，丹参、延胡索、山楂主活血祛痰、化浊降脂、通脉止痛，共为臣药[11-13]；黄连主清热泻肝、宁心止悸[14]，淫养霍、地黄主温肾助阳、补肾滋阴、养血通脉[15-16]，共为佐药；甘草益气通脉、缓急止痛、养心安神[16]，为使药。养心氏片所含皂苷类成分，如黄芪甲苷、人参皂苷等均有增强免疫力、促进血液循环、改善心肌缺血、保护心血管的作用，黄酮类成分如葛根素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷等具有扩张冠状动脉、保护心肌损伤的作用；酚酸类成分如丹酸酸B、阿魏酸等具有活血化瘀、抗动脉粥样硬化、收缩血管、抗肿瘤的作用；生物碱类成分如延胡索乙素、盐酸小檗碱等具有镇静镇痛、抗病毒等作用，因此为有效控制制剂质量，根据中药复方制剂君臣佐使理论及中国药典各药材标准，本研究选择11个有效成分作为养心氏片质量控制指标。

3.2 检测器的选择及条件优化

养心氏片中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1等皂苷类成分的紫外吸收均为末端吸收，紫外吸收波长为203 nm，灵敏度低，基线噪音大，在ELSD条件下色谱峰响应值更大，且人参皂苷Rg1和人参皂苷Re分离效果更好；黄芪甲苷紫外吸收较弱，杂质干扰较大，其含量多采用ELSD测定，既保证基线平稳，又提高了灵敏度；毛蕊异黄酮葡萄糖苷、葛根素、淫羊藿苷为黄酮类成分，阿魏酸、丹酚酸B为酚酸类成分，盐酸小檗碱、延胡索乙素为生物碱类成分，分子结构中均含共轭结构，具有较好的紫外吸收，适用于DAD检测器，故本文采用DAD-ELSD串联测定11个有效成分的含量。

采用DAD检测器190～400 nm全波长扫描对照品溶液和供试品溶液，确定采用254 nm（葛根素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷），278 nm（延胡索乙素、丹酚酸B、淫羊藿苷），316 nm（阿魏酸），345 nm（盐酸小檗碱）分段波长检测法。采用ELSD检测器分析黄芪甲苷、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1，考察不同漂移管温度（90、100、110 ℃）对峰响应值的影响，结果显示ELSD的响应值随漂移管温度升高而增大，为保证高水相流动相的蒸发，选择110 ℃为漂移管温度；考察不同氮气流速（2.0，2.5，3.0 L/min）对测定结果的影响，结果表明氮气流速为2.5 L/min时基线较为平稳，ELSD的响应值高，因此选择2.5 L/min为最终条件。

3.3 样品提取方法优化

本研究采用正交试验分别考察提取溶剂（甲醇水溶液、乙醇水溶液）及浓度（50 %，70 %，90 %）、提取溶剂用量（25，30，35 ml）、提取时间（40，50，60 min）对供试品溶液中11个化学成分提取率的影响，综合正交试验结果及经济环保考虑，确定1.0 g样品采用25 ml 70 %甲醇溶液超声提取（400 W，40 kHz）40 min。

3.4 流动相条件优化

本研究分别考察乙腈-水溶液、乙腈-0.1 %甲酸溶液、甲醇-0.1 %甲酸溶液、甲醇-水溶液几种流动相梯度洗脱系统，结果显示有机相乙腈对色谱峰的洗脱能力优于甲醇，水相中加入0.1 %甲酸时，黄芪甲苷色谱峰峰型显著改善，采用梯度洗脱，各色谱峰峰形和分离度均可达到要求，故选用乙腈-0.1 %甲酸水溶液为流动相系统。