大黄酚及其锌配合物的体外抗氧化活性初步研究

曲子妹，王 脉，王 树，薛贵平

（河北北方学院 药学系 河北省神经药理学重点实验室，河北 张家口 075000）

大黄酚具有抗氧化、抗癌、神经保护、改善学习认知障碍、保护心肌等多种药理活性[1-4]。研究发现大黄酚在体内可增强脑缺血再灌注小鼠脑组织的耐缺氧能力[5]。体外抗氧化试验发现，大黄酚对超氧阴离子自由基（O2-·）的清除能力强于大黄中其他游离蒽醌成分[6]。但大黄酚易被氧化，稳定性较差。

多项研究证实中药单体的金属配合物的药理活性较单体增强，说明中药单体与金属离子具有协同作用[6-7]。基于前期中药单体金属配合物的研究基础[8]，本研究以天然有机活性物质大黄酚为先导化合物，合成了大黄酚-锌金属配合物，并测定其配位前后的抗氧化活性，为中药新药的开发提供思路和方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器

BSA1245型分析天平[十万分之一，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；KS-6000超声波清洗机（宁波科生仪器厂）；DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司）；SHZ-DⅢ型循环水式真空泵（巩义市英峪予华仪器厂）；ELITIST 5K-R型立式低速冷冻离心机（长沙市鑫奥仪器仪表有限公司）；DHG-9140AS型真空干燥箱（宁波江南仪器厂）；UV9100 B型紫外分光光度计（北京莱伯泰科仪器股份有限公司）；ACQUITY QDa质谱检测器（美国Waters公司）；Vario EL III元素分析仪（德国Elementar 公司）；Agilent 7700 电感耦合等离子质谱仪（美国Agilent公司）；Tensor II型傅立叶变换红外光谱仪（德国Bruker公司）。

1.2 药品与试剂

大黄酚（批号：20041611），无水氯化锌（上海鼎瑞化工有限公司）；邻苯三酚，1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，上海瑞永生物科技有限公司）；三羟甲基氨基甲烷（Tris，北京Biotopped Science & Technology公司）；水杨酸（天津市北辰方正试剂厂）；七水合硫酸亚铁[福晨（天津）化学试剂有限公司]；维生素C（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；无水乙醇，无水甲醇，乙酸乙酯，二甲基亚砜（DMSO，天津大茂化学试剂厂）；双蒸水为实验室自制；主要试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 大黄酚-锌的合成

精密称取大黄酚254.0 mg，置于三颈烧瓶中，加入适量无水乙醇，氮气环境下，40 ℃下加热搅拌溶解。精密称取68.0 mg无水氯化锌，溶于适量无水乙醇后，滴入大黄酚无水乙醇溶液中，此时大黄酚醇溶液由黄色变为橙色。用NH3·H2OCH3CH2OH溶液（v:v=1:1）调节反应液pH至7.0，溶液变浑浊，有红棕色沉淀生成，回流4 h。回流结束，反应液冷却至室温，2500 r/min离心5 min，用乙酸乙酯、无水乙醇洗涤沉淀，真空干燥24 h，得红棕色粉末，产率为83.2 %。

2.2 大黄酚-锌的结构表征

2.2.1 紫外可见分光光度法 将大黄酚及大黄酚-锌用无水甲醇溶解，配成浓度为1.0×10-4mol/L的溶液，进行紫外-可见光谱扫描，扫描范围为220～600 nm。大黄酚-锌的峰形与大黄酚基本一致，只是吸收峰的位置及强度发生了改变，见图1。

图1 大黄酚-锌与大黄酚的紫外-可见光谱

大黄酚在225，256，287 nm处有3个较强的吸收峰，是苯环共轭体系与醌样结构谱带；而大黄酚-锌在228，258，288 nm出现吸收峰。大黄酚在428 nm处的吸收峰为醌羰基吸收谱带，大黄酚-锌在432 nm出现醌羰基吸收谱带。此外大黄酚-锌在516 nm左右出现一个新的吸收峰。通过比较得出，大黄酚-锌在苯环共轭体系与醌样结构谱带处的吸收峰有轻微的红移现象。且醌羰基吸收峰位移较大。结果见表1。

表1 大黄酚-锌与大黄酚的紫外吸收峰

2.2.2 红外光谱分析 采用KBr压片法，在400～4000 cm-1范围内对大黄酚及其金属配合物进行红外光谱扫描，结果见图2。

图2 大黄酚-锌与大黄酚的红外谱图

大黄酚-锌在1400～1500 cm-1处的苯环骨架的吸收峰基本无变化。其中，大黄酚的1, 8位酚羟基可与9位醌羰基中的O形成分子内氢键，因此，在2924 cm-1处为缔合羟基的伸缩振动吸收峰，而在配合物的图谱中，该峰明显减弱。此外，C=O伸缩振动峰在大黄酚中位于1628 cm-1，但在大黄酚-锌中位于1605 cm-1，大黄酚-锌中的C=O伸缩振动峰移至低波数处，在520～559 cm-1间出现了M(II)-O伸缩振动吸收峰。结果见表2。

表2 大黄酚-锌与大黄酚的主要红外吸收峰

2.2.3 锌的含量测定 取适量大黄酚-锌，用酸消解，消解雾化后上机测试，检测配合物中金属元素的含量。由参考文献[9]得知蒽醌与金属盐的化学计量比为2:1或者1:1，大黄酚-锌中锌元素含量的实测值是11.57 %，大黄酚与锌的化学计量比为2:1时的锌元素含量理论值是11.43 %。因此推测出大黄酚与锌的化学计量比为2:1。金属配合物的可能组成为C30H18O8Zn。

2.2.4 质谱分析 取适量大黄酚-锌，溶于DMSO，上机测试，收集离子峰。[M+H]+为573，其相对分子质量为572。

2.2.5 元素分析 称取适量大黄酚-锌，以He为载气，加O2燃烧，检测样品中的C、H、N含量，结果见表3。

表3 大黄酚-锌的元素含量

根据相对分子质量及元素含量得出金属配合物的分子式为C30H18O8Zn，与推测的可能组成相吻合。

2.3 大黄酚及大黄酚-锌对DPPH自由基清除能力的测定

分别取20，40，60，80 mg/L大黄酚和大黄酚-锌样品溶液1.0 ml，置于4 ml EP管中，再加入0.02 mmol/L DPPH溶液3.0 ml，混合均匀，室温下避光反应30 min。以无水乙醇为空白，测定A517值，重复3次，求平均值，记为As。分别用相同体积的DMSO代替样品溶液，相同体积的无水乙醇代替DPPH溶液，相同条件下法测定吸光度，记为A0和Ac，维生素C作为阳性对照。

DPPH自由基清除率（%）= （A0-（As-Ac））/A0×100

实验浓度范围内，大黄酚和大黄酚-锌对DPPH自由基的清除率分别为6.47 %～57.4 %和27.0 %～86.3 %，大黄酚和大黄酚-锌对DPPH自由基的清除率与样品的浓度呈正相关。结果表明二者对DPPH自由基均有清除作用，但大黄酚-锌自由基清除作用强于大黄酚。结果见表4。

表4 大黄酚及大黄酚-锌对DPPH自由基的清除作用

2.4 大黄酚及大黄酚-锌对羟基自由基（OH·）清除能力的测定

采用芬顿-水杨酸法，在EP管中依次加2.0 mmol/L FeSO4溶液0.48 ml，1.0 mmol/L H2O2溶液0.48 ml，不同浓度（20，40，60，80，100 mg/L）的大黄酚溶液和大黄酚-锌溶液1.0 ml，37 ℃水浴中加热15 min后，再加入6.0 mmol/L水杨酸溶液0.48 ml，继续在37 ℃水浴中加热15 min，取出后用双蒸水补充体积至4.0 ml，摇匀，以双蒸水为对照，测定溶液510 nm处的吸光度值，重复3次，求平均值，记为As。分别用相同体积的DMSO代替样品溶液，相同体积的双蒸水代替H2O2溶液，相同条件下测定吸光度，记为A0和Ac，维生素C作为阳性对照。

OH·清除率（%）=（A0-（As-Ac））/A0×100

实验浓度范围内，大黄酚的OH·清除率为9.88 %～59.4 %，大黄酚-锌OH·清除率为31.6 %～91.3 %，作用呈剂量依赖性。较高浓度时，大黄酚-锌的OH·清除能力高于维生素C，表明大黄酚-锌有较好的抗氧化性能。结果见表5。

表5 大黄酚及大黄酚-锌对OH·的清除作用

2.5 大黄酚及大黄酚-锌对O2-·清除能力的测定

在EP管中加入0.05 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 8.2）2.0 ml，分别加入不同浓度（20，40，60，80 mg/L）的大黄酚溶液和大黄酚-锌溶液1.0 ml，再加入2.0 mmol/L邻苯三酚溶液0.12 ml，以双蒸水为空白，测定322 nm处吸光度（A）值，每30 s记录一次，共反应4 min。以t为横坐标，A为纵坐标，直线回归得到的斜率即为V1。重复测定3次，求平均值。用相同体积的DMSO代替样品溶液，相同条件测定吸光度，其直线斜率记为V0。维生素C作为阳性对照。

实验浓度范围内，大黄酚的O2-·清除率范围是3.69 %～54.6 %，大黄酚-锌的O2-·清除率范围是27.2 %～84.6 %，作用呈剂量依赖性。且较高浓度的大黄酚-锌O2-·清除能力高于维生素C，表明大黄酚-锌有较好的抗氧化性能。结果见表6。

表6 大黄酚及大黄酚-锌对O2-·自由基的清除作用

3 小结

大黄酚是蒽醌类化合物，具有抗氧化、神经保护等多种药理活性。但由于其含多个酚羟基，易被氧化，使其对自由基的清除能力受到限制。本研究结果表明，锌与大黄酚配位后，其稳定性增加，抗氧化活性增强，说明金属元素与大黄酚经过配位反应产生了协同作用，表明大黄酚金属配合物在抗氧化活性方面有良好的开发前景。