CD36基因缺失通过上调PTP1B基因表达降低小鼠肌肉胰岛素敏感性

脂肪酸转位酶（FAT/CD36）是一种促进长链脂肪酸（LCFAs）摄取和氧化的跨膜糖蛋白，广泛表达于脂肪细胞、巨噬细胞、肌肉细胞、内皮细胞和肝细胞。该蛋白是一种多功能的B类清道夫受体，作为脂质稳态和免疫反应的重要调节因子，在脂质代谢、胰岛素反应和炎症中发挥重要作用，并参与代谢性疾病的发病机制，如肥胖、2型糖尿病、动脉粥样硬化、非酒精性脂肪性肝病。代谢综合征也被称为“胰岛素抵抗综合征”，胰岛素抵抗是代谢综合征的核心组成部分，是代谢性疾病发生发展的重要病理生理因素。

使网络中的f×n个协同成员节点失效，f∈[0,1]为协同成员节点的失效比例，同时记录CPIKN结构与效能稳定性指标的变化情况。

CD36异常高表达可促进代谢综合征和胰岛素抵抗的发生。目前CD36基因缺失对胰岛素抵抗的影响尚存争议，这极大的限制了以CD36作为代谢综合征干预靶点的药物研发。有研究表明，缺乏CD36基因可以保护小鼠免受高脂饮食引起的肥胖、高血糖和胰岛素抵抗。相反的是，遗传性CD36基因缺陷患者在亚洲和非洲人群中较为常见，CD36基因缺陷患者全身葡萄糖摄取降低，同时患者还表现出高脂血症、代谢综合征症状和胰岛素抵抗。大型的队列研究也显示CD36基因表达降低与胰岛素抵抗和2 型糖尿病风险增加有关。CD36基因缺失改善或者加重胰岛素抵抗受什么因素的影响仍然是未知的。我们课题组前期研究发现，在高脂饮食状态下，CD36基因缺失可改善高脂诱导的脂代谢紊乱和胰岛素抵抗，而在正常饮食状态下，CD36基因缺失反而会削弱生理的胰岛素敏感性。这表明CD36对胰岛素抵抗的调控受到营养状态的影响，部分解释了CD36在胰岛素抵抗中扮演矛盾作用的潜在原因。

肌肉是机体主要的胰岛素敏感组织，对调控葡萄糖代谢稳态至关重要，密切参与胰岛素抵抗的发生机制。在高脂饮食状态下，我们已经发现CD36基因缺失可以增强小鼠肌肉组织的胰岛素敏感性，促进葡萄糖的利用。然而，在正常饮食状态下，CD36基因缺失对小鼠肌肉胰岛素敏感性的影响却没有相关报道。在本研究中，我们主要探讨正常饮食状态下，CD36基因缺失调控小鼠肌肉胰岛素信号通路的作用机制。我们发现，CD36基因缺失会导致正常饮食喂养下小鼠的肌肉组织胰岛素信号通路传导受损。肌肉组织中蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）表达在CD36基因缺失小鼠中异常升高，而PTP1B是胰岛素信号传导的负调控因子。本研究首次揭示了在正常饮食状态下，小鼠CD36基因缺失通过促进肌肉组织中PTP1B的表达从而导致胰岛素敏感性受损的分子机制。我们的研究部分解释了CD36基因缺陷患者葡萄糖摄取降低和易发胰岛素抵抗的原因。这一发现提示可将PTP1B作为预防和治疗CD36基因缺陷人群胰岛素抵抗的新靶点。

有关资料显示，我国公众急救知识普及率不超过1%，其中，大学生接受急救培训的大多数为医学类的学生。欧美、日韩等国家大力推行应急救护培训，其中，美国公众基本急救技术普及率达89.95%，新加坡卫生救护知识培训普及率达20%。我国开展公众急救知识培训起步较晚，存在着实施及资金双重困难。在我国人口基数大、幅员辽阔的国情下，在不同区域和不同居民群体中进行急救知识的普及，也存在着许多不同的特性，我国居民急救能力的培养仍然面临着较大的挑战。

1 材料和方法

1.1 动物

野生型（wild type,WT）小鼠为C57BL/6J小鼠，购自重庆医科大学动物中心，许可证号为SYXK(渝)2012-0001。全身性CD36 敲除（CD36）小鼠由美国Maria Febbraio教授惠赠（Lerner Research Institute,U.S.）。所有的动物实验均符合实验动物伦理委员会规定的标准（2014056）。

1.2 主要试剂

饲料（D12450B）；TRIzol RNA提取试剂、逆转录试剂盒和SYBR Green PCR Master Mix（TaKaRa）；细胞总蛋白提取试剂（凯基公司）；BCA蛋白含量检测试剂盒（北京鼎国公司）；AKT、p-AKT、IRβ、IRS1、IRS2、PI3K抗体购自CST；PTP1B 抗体（Proteintech Group）；抗βactin抗体（北京博奥森公司）；免疫共沉淀（Co-IP）试剂（LSKMAGG02）、PVDF膜（Millipore）；免疫荧光二抗（中杉金桥公司）；ECL化学发光试剂（Bio-Rad）；引物由擎科引物公司合成；血糖检测仪（罗氏）；葡萄糖检测试剂盒（北京普利莱基因技术公司）；胰岛素（诺和诺德）；胰岛素试剂盒（北京鼎国公司）；claramine（Sigma-Aldrich）。

1.3 动物选择与分组

正常饮食喂养结束后，所有小鼠禁食过夜，每组各选6只腹腔注射1 units/kg的胰岛素，10 min后收集骨骼肌，-80 ℃保存备用。用总蛋白提取试剂盒提取肌肉总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度。SDS-PAGE电泳分离蛋白，PVDF膜转膜，37 ℃条件下3%BSA封闭1.5 h，4 ℃条件下孵育一抗(抗AKT、p-AKT、IR、IRS1、IRS2、PTP1B和β-actin抗体)过夜，TBST洗3次，每次15min，HRP 标记的二抗室温孵育1 h，TBST 清洗3 次，每次15 min，利用化学发光剂ECL 显影，条带的强度用ImageJ软件（灰度×面积）进行定量分析。

1.4 葡萄糖耐量实验（GTT）和胰岛素耐量实验（ITT）

检测该过程是根据制造商的说明用Magna ChIP G试剂盒（Millipore）进行的。PTP1B启动子特异性引物（表1）。

1.5 Western blot检测蛋白表达

根据基因型将小鼠分为WT组和CD36组，每组12只，正常饮食喂养14周。

1.6 免疫荧光染色

我国《律师法》修订多次，始终保留着“公务员不得兼任执业律师”的规定。现行的公职律师制度与《律师法》规定存在冲突，公职律师缺少合法的身份依据。建议应当尽快修改《律师法》，尽早实现“形成社会律师、公职律师、公司律师、军队律师并存发展、相互配合，优势互补的格局”，把公职律师纳入我国律师制度的整体框架中，为其提供合法的身份依据，在法律上确认其角色定位，明确相关权利义务。

1.7 RT-PCR检测mRNA表达

Western blot 检测正常饮食喂养条件下WT 和CD36小鼠肌肉中胰岛素刺激的蛋白激酶B（AKT）磷酸化水平，结果显示P-AKT/AKT蛋白表达比值显著降低（＜0.01，图2A、B）。CD36小鼠肌肉中葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）表达降低，肌肉组织的葡萄糖利用能力减弱（图2C）。胰岛素信号传导通路中AKT 上游的mRNA和蛋白表达情况显示CD36小鼠肌肉中胰岛素受体（IR）和胰岛素受体底物1/2（IRS1/2）的mRNA水平没有降低（图2D），并且两组小鼠肌肉中IR、IRS1、IRS2和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）的蛋白水平均没有显著差异（＞0.05，图2E、F）。

1.8 免疫共沉淀

将等量的小鼠肌肉蛋白裂解物与抗体在4 ℃条件下孵育过夜，然后添加G蛋白磁珠（LSKMAGG02）孵育2 h，冷裂解缓冲液洗涤3次后，将结合的蛋白质在SDS样品缓冲液中煮沸5 min以洗脱，SDS-PAGE电泳分离上清液蛋白，并用抗IR和IRS1酪氨酸磷酸化的抗体免疫印迹。

1.9 染色质免疫共沉淀（ChIP）

正常饮食喂养14周时，所有小鼠禁食12 h，取尾静脉血，用血糖检测仪测定此时血糖浓度，计为0 min的血糖浓度。然后腹腔注射1 g/kg的D-葡萄糖，分别在30、60、90、120 min后测定所有小鼠的血糖浓度，即为GTT实验。ITT实验则将小鼠禁食4 h，腹腔注射1 units/kg的胰岛素，同样取尾静脉血，用血糖仪测定0、30、60、90、120 min的血糖浓度。

1.10 统计学处理

本研究实验数据均采用软件SPSS25.0进行统计学分析，数据均以均数±标准差，采用-test对两样本进行比较，以＜0.05为差异有统计学意义。

斑潜蝇主要危害西葫芦叶片，在叶片内幼虫蛀食造成弯曲的隧道，破坏叶绿素和叶肉细胞，严重时叶片枯死甚至成片植株死亡。

2 结果

2.1 CD36基因缺失引起小鼠胰岛素敏感性受损

免疫共沉淀（Co-IP）检测小鼠肌肉组织中胰岛素反应蛋白质的酪氨酸磷酸化水平。结果显示，与WT小鼠相比，CD36小鼠肌肉中总蛋白的酪氨酸磷酸化水平明显降低（＜0.05，图3A、D）。CD36小鼠肌肉中IR的酪氨酸磷酸化水平显著降低（＜0.01，图3B、E），同时发现IRS1的酪氨酸磷酸化水平也降低（＜0.05，图3C、F）。

云南省曲靖市麒麟区某水库位于南盘江右岸一级支流白石江上，控制流域面积18.3km2，水库总库容401万m3，兴利库容357万m3，是一座以灌溉、防洪为主，兼有城市供水等综合效益的小（1）型水库。工程等别为Ⅳ等，主要水工建筑物级别为4级，次要建筑物级别为5级。除险加固防洪设计标准为：挡泄水建筑物按30年一遇洪水设计，300年一遇洪水校核。正常水位1941.23m，死水位1921.73m，设计洪水位1 941.77 m，校核洪水位1 942.57 m，汛限水位1 939.23 m。

按照免疫荧光试剂盒说明书，小鼠肌肉组织切片用山羊血清封闭15 min，抗GLUT4 抗体4 ℃条件下孵育过夜（放在湿盒中），室温下避光加入山羊抗兔IgG-FITC孵育30 min，DAPI染液作用10 min，PBS冲洗，黑暗条件下防荧光淬灭剂封片，共聚焦荧光显微镜下观察。

2.2 小鼠CD36基因缺失降低肌肉组织胰岛素敏感性

TRIzol试剂提取肌肉总RNA，并检测其含量和纯度，用逆转录试剂盒在37 ℃5 min、85 ℃5 s、4 ℃5 min条件下1 μg总RNA逆转录成cDNA，并保存于-20 ℃。取2 μL cDNA进行RT-PCR，β-actin作为内参，反应总体积为25 μL，设置扩增条件为：94 ℃预变性1 min；94 ℃变性10 s、54 ℃退火10 s、72 ℃延伸10 s，共39个循环。记录每个标本和内参的Ct值，根据2计算目的基因的表达水平。

2.3 小鼠CD36 基因缺失抑制肌肉IR/IRS1 酪氨酸磷酸化

正常饮食喂养14 周后，注射1 U/kg 的胰岛素或1 g/kg的葡萄糖，检测所有小鼠0、30、60、90、120 min的血糖水平，并分析胰岛素敏感性的差异或糖耐量差异。与WT小鼠相比，CD36小鼠对胰岛素的敏感性明显减弱（图1A），胰岛素耐量曲线下面积显著升高（＜0.05，图1B）。CD36小鼠糖耐量明显升高(图1C)，糖耐量曲线下面积显著降低（＜0.01，图1D）。CD36小鼠血清胰岛素浓度升高（＜0.01，图1E），胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）也升高（＜0.05，图1F）。

2.4 CD36基因缺失通过促进肌肉中PTP1B的表达降低小鼠的胰岛素敏感性

CD36小鼠肌肉中PTP1B mRNA 水平明显升高（＜0.01，图4A），并且PTP1B的蛋白表达水平也显著高于WT 小鼠（＜0.05，图4D、E）。与WT 小鼠相比，CD36小鼠肌肉中乙酰组蛋白3（H3）与PTP1B启动子的结合水平增加（＜0.01，图4B、C）。而claramine 对PTP1B的药理抑制有效地消除了CD36小鼠的胰岛素敏感性受损（图4F、G）。

3 讨论

多项研究发现CD36和胰岛素抵抗的病因有关，但其潜在的机制仍然不清楚。有文献报道在肥胖相关的2型糖尿病患者中CD36过表达减弱胰岛素信号传导，产生胰岛素抵抗。因此通常认为CD36缺乏可以改善高脂肪饮食诱导的肥胖和胰岛素抵抗。但近期有研究显示，人类CD36基因缺陷患者表现为胰岛素抵抗和高脂血症，并出现代谢综合征症状。自发性高血压大鼠缺乏CD36表现为胰岛素抵抗和高游离脂肪酸（FFA）水平的代谢表型，转基因过表达CD36可改善这一表型。我们推测CD36在胰岛素抵抗中矛盾的作用可能是由营养状态不同所导致的。课题组前期研究发现在高脂饮食状态下，CD36基因缺失可以增强小鼠肌肉的胰岛素敏感性。而本研究结果表明，在正常饮食状态下，CD36基因缺失导致小鼠肌肉胰岛素敏感性受损，提示CD36基因缺失对肌肉胰岛素敏感性的影响依赖于营养状态的调控。因此将CD36作为治疗临床多种代谢性疾病的靶点时必须要考虑不同营养状况对疗效的影响。

手机是抵御聒噪的神器，根据聒噪的级别调节不同的节目。比如对方的语音语调和风细雨，不影响我刷屏看文字，就首选微信微博；如果对方语音高亢语调激昂，逼你入脑入心，分心的方式就只能是看淘宝；如果对方的言辞激烈，好像你欠他2000元钱似的，这就是在逼我出手了，只好在购物车里划拉，对自己好一点吧，该买的就买，否则咋办？人家已经对咱这么不客气，咱自己总得对自己客气些吧？

经典的胰岛素信号包括IR、IRS1、IRS2、PI3K 和AKT等，它们在胰岛素在许多类型的细胞和组织的代谢活动中发挥着重要作用。IR属于酪氨酸激酶家族，由α亚基和β亚基组成，胰岛素发挥生物学作用首先与细胞膜上的IRα结合，使IRβ自身磷酸化，随后通过IRS1、IRS2、PI3K和AKT等信号通路发挥一系列生物学效应。其中AKT的磷酸化激活是反应胰岛素敏感性的金指标。本研究发现在正常饮食条件下，CD36小鼠肌肉中p-AKT/AKT的蛋白比值和GLUT4的表达显著降低，提示CD36基因缺失降低肌肉组织的胰岛素敏感性，且葡萄糖利用能力减弱。接着检测胰岛素信号通路中AKT 上游的mRNA 和蛋白表达情况，发现CD36小鼠肌肉中IR、IRS1、IRS2和PI3K的mRNA和蛋白水平均没有显著差异，提示CD36小鼠不是通过降低肌肉中IR/IRS1/IRS2/PI3K信号通路的蛋白表达水平导致胰岛素敏感性受损。胰岛素信号通路是由IR引发的蛋白质酪氨酸磷酸化级联激活的，因此我们分析了小鼠肌肉中胰岛素反应蛋白质的酪氨酸磷酸化水平。结果显示，CD36小鼠肌肉中胰岛素刺激的IR和IRS1的酪氨酸磷酸化水平明显降低，表明CD36基因缺失可以通过降低肌肉中IR/IRS1的酪氨酸磷酸化水平抑制胰岛素信号通路传导。而胰岛素信号通路的缺陷是胰岛素抵抗的主要原因。以上结果提示在正常饮食条件下，CD36基因缺失可以通过抑制IR/IRS1的酪氨酸磷酸化信号传导导致肌肉组织胰岛素敏感性受损。

胰岛素在发挥作用过程中最重要的是与胰岛素受体结合，使胰岛素受体磷酸化从而激活下游信号通路，而PTP1B能够使磷酸化的胰岛素受体去磷酸化，从而阻断下游信号通路的激活。因此，PTP1B作为胰岛素信号传导的重要负调控因子，在胰岛素抵抗中发挥着重要作用。目前PTP1B已成为治疗2型糖尿病的新靶点。研究发现，小鼠体内PTP1B是全身胰岛素敏感性的主要调节因子。PTP1B小鼠在肝脏和肌肉两大主要代谢靶组织中表现出增强的IR和IRS1酪氨酸磷酸化。我们首次揭示了CD36在调节小鼠肌肉组织中PTP1B表达的作用。本研究发现在正常饮食条件下，CD36小鼠肌肉中PTP1B表达增加，且PTP1B基因启动子的组蛋白乙酰化水平也显著升高。本课题组前期研究显示CD36 可以通过ROS 影响肝细胞组蛋白去乙酰化酶HDAC表达水平，进而调控靶基因启动子组蛋白乙酰化水平，提示CD36可以影响基因的表观修饰，CD36小鼠肌肉PTP1B 启动子乙酰化水平升高可能与ROS/HDAC途径相关，但具体的分子机制还有待进一步解析。此外PTP1B抑制剂阻断了CD36基因缺失对小鼠胰岛素敏感性受损的影响。以上结果表明，PTP1B在CD36小鼠肌肉的胰岛素信号传导中发挥了重要作用，提示CD36基因缺失可以通过促进PTP1B的表达从而抑制胰岛素信号传导引起肌肉组织的胰岛素敏感性受损。

综上所述，在正常饮食状况下，CD36基因缺失通过削弱IR/IRS1通路的酪氨酸磷酸化导致肌肉组织的胰岛素敏感性受损，其机制可能与PTP1B基因的表达上调有关。该研究表明CD36基因对于维持肌肉生理的胰岛素信号通路传导至关重要，CD36基因以非脂质依赖的分子机制调控生理胰岛素信号通路。我们的研究结果为阐明临床上CD36基因缺陷患者葡萄糖摄取降低和易发胰岛素抵抗这一现象提供了理论依据。