白三烯B4受体在急性髓系白血病中的预后价值和功能富集分析

急性髓系白血病（AML）是一种以原始造血细胞无序增殖为特征的骨髓恶性肿瘤，发病率和死亡率随着年龄的增长而增加。由于该疾病的遗传学复杂性，世界卫生组织（WHO）分类和诊断标准（2016 版）除临床特征、形态学和免疫表型外，还纳入了多种重现性细胞遗传学和分子遗传学特征，如PML-RARα、RUNX1-RUNX1T1、FLT3-ITD、TP53、DNMT3A 和NPM1 突变等。目前，临床工作者主要通过年龄、细胞遗传学异常和特定基因突变来评估AML 患者的预后。然而，大约有40% AML 患者被归类为中危患者，其中大多数未携带常见的核型异常或基因改变。随着医疗技术的进步，近10年来，AML治疗方案也有较大改观。AML风险分层策略和预后评估方案已不能满足临床需要。二代测序技术的广泛应用，肿瘤公共数据库海量的测序和临床信息为基因标志物筛选提供了技术基础。国内外科学家已经进行了多项研究来寻找新型预后生物标志物并改善不同AML 亚组的风险分层和预后评估。肿瘤发生、进展相关重要信号通路，比如免疫微环境、铁死亡、脂质和能量代谢、DNA修复和损伤有关的基因组经过生物信息学模型处理可以作为预后判断的工具。HMGA2、FHL1、HOPX 和FAM124B等基因特征被证实为有效的单个预后分子指标。但是这些基因标志物的临床应用比较局限。由于参与肿瘤发生的信号通路基因之间相互调节、影响，有必要挖掘潜在的AML新型基因标志物，完善肿瘤调控信号通路网络机制。我们前期利用公共数据库筛选了TCGA-AML 队列中的多个预后相关基因，这些基因大部分未见诸报道，其预测准确性和有效性也未经过临床实验验证。本项研究中，我们通过生物信息学分析探讨了AML肿瘤患者骨髓组织白三烯B4受体（LTB4R）的异常表达水平、预后价值和潜在生物学功能，并收集临床标本进行了初步验证。LTB4R，又称BLT1，是LTB4的高亲和力受体，二者相互作用不仅可募集不同类型的炎症细胞、激活炎症反应，也可作用于非免疫细胞启动和/或放大各种组织中的病理性炎症，在肿瘤组织中二者作用于不同的靶细胞呈现出更为复杂的抑癌或促癌效应。已有研究报道LTB4R与实体肿瘤预后的相关性及作为治疗靶点的潜力，如LTB4R在胰腺癌、表皮肿瘤、结肠癌组织过表达，促进肿瘤细胞增殖，调控细胞周期、诱导凋亡。另外，也可通过MMP-2途径增强乳腺癌细胞的侵袭性，小鼠皮下肿瘤模型中证实LTB4R介导CTL 细胞在肿瘤组织中的浸润。肿瘤免疫微环境在肿瘤发生、发展、转移、侵袭过程中发挥重要作用，因此调控免疫功能可能是预防和治疗肿瘤的手段之一。针对AML患者的免疫治疗手段也在不断发展。目前，LTB4R在AML中的表达模式，预后价值，及其是否或如何影响AML患者的免疫微环境尚未见报道。本研究运用生物信息学工具分析了LTB4R在AML患者中的表达模式、预后价值和潜在生物学功能。

1 资料和方法

1.1 资料

1.1.1 样本及试剂 本研究分析的数据集由美国国家癌症研究所（NCI）TCGA 癌症（TCGA-LAML）https://portal.gdc.cancer.gov/、GTEx（正常组织）https://gtexportal.org/home/datasets 和 Gene Expression Omnibus（GEO:GSE12417）https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo下载。数据集TCGA-LAML于2020 年1月更新，纳入173例AML患者，包含高通量测序（RNASeq）数据，其中151例含详细的临床信息（140例含预后信息）、细胞遗传学和分子突变信息，以上数据集执行R studio数据清洗“dplyr”包删失信息不全的病例后纳入生存分析和Cox回归分析。

AML患者（=30）及健康对照者（=21）外周血样本2020年2月～2022年1月于山东第一医科大学第一附属医院收集，EDTA-K2 抗凝血用于分离外周血单个核细胞，促凝血1500 r/min离心5 min后分离血清保存至-80 ℃备用。AML外周血样本经人工镜检分类筛选，白血病原始细胞比例≥20%或＞2000/μL的样本（=19）纳入本研究。实验前均获得患者知情同意。本研究经山东第一医科大学第一附属医院伦理委员会批准，批号为：2021[伦审字（S092号）]。

Ficoll 淋巴细胞分离液（天津灏洋），Trizol（Invitrogen），ReverTra Ace qPCR RT kit（Toyobo），SYBR Green Realtime PCR Master Mix 试剂盒（Toyobo），实时荧光定量PCR扩增仪ABI QuantStudio 5（ABI）。β-actin、LTB4R、HAVCR2、PDCD1引物由上海生工合成，序列如下：β-actin_180 bp：F：5'-CTCAC GAAACTGGAATAAGC-3'；R：5'-AAGCCACACGTA CTAAAGGT-3'；LTB4R_162 bp：F：5'-AGCTTTGTG GTGTGGAGTATCC-3'，R：5'-GCAACCAGCCAGTC CAAAAC-3'；HAV-CR2_75 bp：F：5'-CTGCTGCTAC TACTTACAAGGTC-3'，R：5'-GCAGGGCAGATAGG CATTCT-3'；PDCD1_137 bp：F：5'-CCAGGATGGTTC TTAGACTCCC-3'，R：5'-TTTAGCACGAAGCTCTCC GAT-3'。人LTB4R酶联免疫吸附实验（ELISA）试剂盒购自上海凡科维公司，检测范围1～55 pg/mL。酶标仪为Thermo Multiskan Go。

1.1.2 数据库 利用基于网络生物信息学平台，如PrognoScan、Linkedomics、UALCAN和WebGestalt和STRING（https://string-db.org/）进行生存分析、相关性分析、共表达基因筛选、功能富集分析和蛋白相互作用PPI（protein-protein interaction）网络构建。利用R包“UpSetR”绘制Upset图可视化共表达基因与免疫浸润、DNA损伤修复、能量代谢、EMT相关基因的交集情况。采用R包“GSVA”内置ssGSEA算法分析TCGA-LAML数据集中LTB4R与24种免疫细胞标志、免疫检查点基因相关性。

1.2 方法

为进一步在临床样本中验证LTB4R在AML中的表达水平及其与相关免疫检查点基因表达的相关性，我们收集了白血病原始细胞比例≥20%或＞2000/μL 的AML患者外周血样本，分离PBMC进行RT-PCR实验，检测各基因mRNA 表达水平，ELISA 实验检测血清LTB4R蛋白表达水平。图8显示在19例AML患者样本中，LTB4R mRNA表达量高于对照样本（=21），同时LTB4R mRNA 表达量与HAVCR2 呈显著正相关（＜0.05），与PDCD1正相关，但无统计学意义。AML患者血清LTB4R表达水平显著高于正常对照样本[（15.93±3.28）pg/mL（6.71±1.05）pg/mL，=0.0083]。

为了进一步探索LTB4R基因在AML中的潜在功能和分子途径，我们利用LinkedOmics 数据库分析了TCGA-LAML数据集中173例患者的mRNA 测序数据，共筛选出与LTB4R相关的10 477个基因（＜0.01）。共表达热图显示了与LTB4R表达呈正相关或负相关的Top10基因（图4），参与炎症反应、代谢、胞膜运输、细胞凋亡等一系列生物学功能。我们通过GO和KEGG分析在TCGA-LAML 数据集中富集了LTB4R共表达基因簇的功能和信号途径。气泡图显示基因簇富集于生物学进程（BP）免疫反应相关的中性粒细胞活化、T细胞活化、细胞活性正向调节、白细胞粘附正向调节等生物学过程中（图5A）；这些基因簇在细胞成分（CC）方面是分泌性颗粒膜、溶酶体和细胞粘附蛋白复合体的推定结构成分（图5B）；在分子功能（MF）方面，它们涉及肌动蛋白及骨架绑定、SH2结构域绑定和NADPH氧化酶活性等（图5C）。KEGG分析富集了与共表达基因簇相关的7条通路（＜0.05），如B细胞受体信号途径、FcγR介导的吞噬作用、肿瘤中心碳代谢（图5D）。另一方面，肿瘤发生涉及免疫微环境、能量代谢、缺氧、铁死亡、N6-甲基腺苷（m6A）等关键信号通路，UPSET 交集图显示，LTB4R共表达基因簇中132个为免疫相关基因，34个脂代谢相关基因，34个EMT相关基因，22个代谢调控分子和8个DNA损伤、修复调控分子（图5E）。肿瘤在发生发展过程中可逃避免疫监视、诱导免疫耐受，因此我们继续分析了LTB4R与免疫浸润细胞和免疫检查点分子的相关性。图6A 显示，LTB4R 与免疫抑制细胞Treg、Th17、iDC、Tem 细胞呈正相关，而与T helper、CD8+T、Tcm、NK细胞呈负相关；图6B显示LTB4R与HAVCR2、PDCD1呈显著正相关。PPI网络分析结果显示在AML中与LTB4R信号通路关联密切前15位的蛋白包括LTB4R2、ALOX5、APALOX5、GPK6、GNAQ等，分别涉及肿瘤相关T细胞活化、炎症反应、Wnt信号通路、肿瘤相关跨膜信号转导、G蛋白信号转导复合体和能量代谢。

探究前的知识储备：教师引导学生复习绿色植物在光合作用中的物质变化和能量变化的实质，重点回顾化学能贮存在有机物中的要点，点亮学生思维中关于能量和物质之间的关联，也为后面的探究埋下伏笔。

1.2.3 基因本体论（GO）和京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析 我们利用(http://www.webgestalt.org/option.php)平台对LTB4R及Top200共表达基因进行功能富集分析。选择内置的参考人类蛋白质编码基因组作为背景参数。通过“ggplot”和“dplyr”R包生成气泡图。（-log10）值＞1.3被认为富集到有意义的信号通路。

原因何在？我们可以从平顶山环境污染防治攻坚战领导小组办公室印发的一份通知中得到答案。该通知针对改善空气质量共提出了25项重点任务，其中涉及“科学规划营运加油站点”：要求6月底前，市内四个国控空气质量自动监测站点周边2公里范围内营运加油站完成选址搬迁……搬迁前，即日起范围内加油站营业时间改为每日19时至次日8时。

肿瘤大标本实质部分切面形态为鱼肉状，颜色呈灰白色，质地脆弱，瘤内存在坏死囊变、出血等表现。肿瘤与网膜、肠系膜、腹壁、膀胱发生粘连的患者有3例；坏死肿块与肠道相通伴发感染的有1例。烂鱼肉状是患者肿瘤组织主要形态，肿瘤内坏死除可抽出暗红色血液。延迟扫描表现为大部分强化的1例患者肿瘤动脉期周边见不规则环形与结节状强化。CT诊断提示肿瘤坏死，病理标本显示未发生肿瘤坏死。

1.2.4 基因集富集分析（GSEA）分析 TCGA-LAML数据集基于LTB4R 表达中位数分为两组，采用R 包“DESeq2”筛选差异基因。对所有差异基因进行GSEA功能富集分析，＜0.05，FDR＜0.25认为富集到有意义的信号通路。

目前AML患者的风险分层策略包括临床病理特征、染色体和基因异常。我们利用R studio和UALCAN平台研究了LTB4R表达水平与AML临床资料之间的关系，结果显示在M0、M1、M4、M5亚组中，LTB4R表达水平增强，在M2、M3或t（15;17）、t（8;21）组LTB4R表达水平降低，这与基于风险分层的预后结果一致。LTB4R表达水平与FLT3突变、IDH、RAS突变未呈现显著相关性，可能与样本量过小有关。以上结果提示LTB4R可以作为特定AML亚组，尤其是M0、M1、M4、M5的风险评估指标，并显示出与当前风险分层策略的协同性。

1.2.5 实时荧光定量PCR Ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，Trizol法提取总RNA，使用ReverTra Ace qPCR RT kit 获得互补cDNA。使用SYBR Green Realtime PCR Master Mix试剂盒在ABI QuantStudio 5PCR仪上进行PCR扩增。设阴性对照2复孔，每个样本设2个复孔，内对照为1×ROX，PCR循环条件如下：预变性95 ℃60 s，40个循环95 ℃15 s，60 ℃15 s，72 ℃45 s。mRNA表达水平半定量计算公式为2。

1.2.6 酶联免疫吸附实验（ELISA）分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。每孔加50 μL样本（血清1∶5稀释）。用酶标仪测定吸光度（），通过标准曲线计算样品中人白三烯B4 受体(LTB4R)浓度。每孔读取3次取平均值。

1.2.7 统计学分析 基因表达TPM（每千碱基百万读数的转录本）格式的RNAseq 数据通过UCSC XENA（https://xenabrowser.net/datapages/）中的Toil 流程进行处理。定量数据经过正态检验，非正态分布数据用中位数和四分位距表示（mean±IQR）。Mann-Whitney U检验用于评估两个独立样本中log2（TPM+1）水平的差异。散点图是通过R studio（3.6.3）中的“ggplot2”R 包绘制。生存分析值和风险系数（HR）由单因素Cox风险回归和对数秩检验生成。临床资料基线分析将数据集TCGA-LAML（=140）基于LTB4R表达水平的中值作为临界值分为高表达组和低表达组，基因表达与临床特征之间的关系采用Chi-square 检验，Wilcoxon rank sum检验或Fisher精确检验。正态分布数据以均数±标准差表示，两组间比较采用Student检验。相关性分析采用Spearman检验。使用R studio 3.6.3和Excel软件进行统计学分析和可视化。＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LTB4R mRNA在AML患者中的表达水平及预后价值

TCGA-LAML数据集基于LTB4R表达水平分为两组，应用R语言筛选出313个差异基因（或lncRNA）（|log2FoldChange|＞2，＜0.05），火山图（图7A）显示其中58个红色散点为表达上调基因，255个蓝色散点为表达下调基因，Top5代表基因为：SLC10A2、HMX3、KCNN2、LINC00482、LAMP5-AS1、PDPN、AL117190.1、MEG9、RASL12、MEG8，其余基因以灰色散点表示。继而针对总差异基因进行GSEA功能富集分析，结果如图7B显示，基于LTB4R的差异基因富集于CD4+αβT细胞分化、αβT细胞活化，免疫相关的T细胞活化、II型免疫反应、免疫递呈突触、TNF受体绑定、IL-2/STAT5、TGF-β信号途径。

2.2 LTB4R可作为AML 的独立预后指标

1970～80 年代沿用的急性髓系白血病FAB 分型（M0-M7）主要基于形态学和细胞化学染色。随着分子生物学技术的发展，世界卫生组织（WHO）分类标准纳入了一系列与癌基因、抑癌基因、细胞功能相关的重现性遗传学异常，如t（15;17）（q22;q12）、PML-RARα、t（8;21）（q22;q22）、RUNX1-RUNX1T1、FLT3-ITD突变和NPM1突变。目前临床上采用这些细胞遗传学异常与临床特征做为风险分层指标。为研究LTB4R是否能辅助AML疾病风险分层，取LTB4R表达水平中位数为介值，结合各项临床指标将TCGA-LAML 队列分组进行相关性分析，表1显示LTB4R过表达水平与细胞遗传学风险（＜0.001）、FAB分型（＜0.001）、染色体异常（＜0.001）和NPM1突变（=0.023）相关。LTB4R低表达组的重现性细胞遗传学异常具有更好的临床预后，例如全部t（15;17）（11/11，100%）和t（8;21）（7/7，100%）患者均为LTB4R低表达。LTB4R 表达水平在FAB 各亚型中显示出不同的分布特征，M1（22/35,62.9%）、M4（18/29，62.1%）和M5（13/15，86.7%）患者LTB4R表达更高，相反，大多数M2（60.5%）和M3（急性早幼粒细胞白血病，APL，80.0%）呈LTB4R低表达。另一方面，利用UALCAN 平台分析了不同FAB 分型、年龄、性别、FLT3 突变、PML/RAR 融合和RAS 激活状态亚组的LTB4R表达水平（图3）。柱状图显示，M3 占AML 的9%～12%，与M3 相比，M0、M1、M2、M4 和M5 中LTB4R表达水平升高（＜0.001，图3A）。LTB4R在其他亚组之间未显示明显差异（图3B～F）。

2.3 LTB4R表达水平与临床指标相关性分析

多种临床特征如年龄、白细胞计数、原始细胞百分比和细胞遗传学异常，都可能会影响AML 患者的预后。既往有多项基于全基因测序的AML预后相关变量的筛选研究，FHL1、HOPX、HMGA2 和FAM124B被证实为预后候选基因。本研究在此基础上运用单因素和多因素Cox 风险回归分析，以确定LTB4R是否可作为AML OS 独立预后因子。联合LTB4R纳入分析的变量包括年龄（≥60 岁）、外周血白细胞计数和原始细胞百分比、常见细胞遗传学异常或治疗靶点（FLT3 突变、DNMT3A 突变和TP53 突变）、预后基因指标（HMGA2、FHL1、HOPX 和FAM124B）（图2）。图2A森林图显示年龄、FAB分型、细胞遗传学风险、LTB4R（HR=1.825；95%：1.188-2.802；=0.006）、FHL1、HOPX、FAM124B均表现出风险预测价值，多因素分析则证实LTB4R、年龄和FAM124B 为独立预后风险因子，其中LTB4R 显示出较强的独立风险预测价值（=0.019，HR=1.864，95%：1.107-3.136，图2B）。

2.4 LTB4R共表达基因筛选及功能富集分析

1.2.2 单因素和多因素Cox 回归分析 采用Cox 回归分析来筛选TCGA-LAML 队列（=140）中的预后候选基因。使用“survival”、“survminer”、“forestplot”R 包绘制森林图。年龄、细胞遗传风险和基因突变被视为分类变量，而白细胞计数和原始细胞百分比视为连续变量。采用每个基因的表达水平中位数为介值分组。

2.5 基于LTB4R的差异基因筛选及GSEA分析

利用R studio 分析TCGA数据库来源的泛癌组织中LTB4R 基因的转录水平（图1A）。散点图显示AML患者骨髓样本（TCGA-LAML，=173）中LTB4R转录水平显著高于正常组织（GTEx，=70）（4.898±1.2202.252±0.215，＜0.001）。我们对基因表达数据和生存期进行了单变量Cox 比例风险回归分析筛选出TCGALAML 数据集（=140）中2563 个预后相关基因（Cox＜0.01），其中LTB4R mRNA高表达与总生存期（OS）显著相关（HR=1.42，95%：1.13-1.79；Cox=0.003）。随后利用R studio（图1B）和PrognoScan平台（图1C）不同数据处理算法评估LTB4R基因在AML患者中的预后价值。Kaplan-Meier（KM）曲线图显示在TCGALAML数据集（数据清洗后=140）中LTB4R 异常表达与总生存期（OS）相关（HR=1.74，95%：1.14-2.67；=0.011），LTB4R高表达组的中位生存时间为11.2月，低表达组为27.4月。LTB4R 的预后价值用PrognoScan平台进行了验证，Cox风险回归分析显示在细胞遗传学正常的AML 数据集GSE12417[（AMLCG（2004），=79，HR=1.72，95%：1.06-2.77；=0.027，图1C]中LTB4R过表达是OS 的危险因素。利用时间操作特征(TimeROC)分析确定预测准确性。曲线下面积（AUC）分别为1 年AUC=0.613、3 年AUC=0.675、5 年AUC=0.748（图1D）。

2.6 临床实验验证LTB4R、免疫检查点基因表达水平及相关性

1.2.1 生存分析 通过数据清洗纳入了TCGA-LAML数据集中140名具有高通量测序（RNA-Seq）和完整预后信息的AML 患者。生存分析结果由Kaplan-Meier曲线显示。TimeROC（v 0.4）分析用以比较单个基因或基因组的预测特异性及灵敏性。以上利用R 包“survival”、“survminer”、“pROC”和“ggplot2”分析绘图。

3 讨论

我国白血病发病率约为3～4/10万，其中AML占1.62/10万，目前病因尚不完全清楚，已知的有病毒感染、免疫功能异常、物理、化学、遗传因素等。除M3外，其他类型的AML治疗手段以化疗和造血干细胞移植为主，5年死亡率达50%。以肿瘤疫苗、细胞治疗和细胞信号通路调节剂为代表的选择性免疫治疗和分子靶向治疗是新兴的治疗措施，而个体化的治疗方案要求全面检查各种预后分层相关的预后指标。迄今，临床和科研工作者筛选了大量新型的AML生物标志物和预后指标。在此基础上，本研究利用多种生物信息学分析工具，借助公共数据库平台，试图筛选更简单、有效的预后指标。前期我们已通过Cox风险回归分析筛选出多个预后基因，如RHOBTB2、FHL1、HIVEP3、ARHGAP9和PSMB8，这些基因的潜在功能和预后价值有待验证。本项研究中，我们探讨了LTB4R基因在AML中的表达谱和预后意义。

TCGA泛癌数据集基因表达分析显示AML患者骨髓组织中LTB4R转录水平显著升高，并且在泛癌组织中表达水平差异明显，呈现出器官特异性。急性髓系白血病患者骨髓样本中白血病细胞的比例为20%～100%，这可能决定基因表达水平的分布情况。急性髓系白血病患者骨髓中LTB4R异常表达促使我们进一步探索其是否具有预后价值。

我们利用R studio 和PrognoScan 在两个不同的AML数据集中分析并验证了LTB4R基因对AML患者预后的影响，结果显示LTB4R过表达与AML患者的不良预后相关。TimeROC分析显示LTB4R的AUC大于0.6，尤其是5年AUC=0.748，显示出较强的预后评估性能。我们前期收集了一组与AML预后相关的风险因素，包括年龄、白细胞计数、原始细胞比例、重现性遗传学异常等，均纳入Cox风险回归分析，多因素回归结果证实LTB4R是AML不良预后的独立预测基因。

基于“调整结构、补齐短板、提升质量”，推进供给侧改革，以精准扶贫为核心，“输血”与“造血”相结合，从目标层、战略层和路径层提出供给侧改革视角下精准扶贫优化路径，对接扶贫资源供需，确保贫困地区精准脱贫，见图4。

LTB4R属于G 蛋白偶联受体（GPCRs）超家族，特异性表达于白细胞，在胰腺癌、表皮肿瘤、结肠癌中的表达水平异常，并可发挥调控免疫微环境、促进肿瘤增殖和侵袭的功能生物学功能。然而，LTB4R能否以及如何调控肿瘤免疫并影响白血病的发生发展尚不清楚。

现金流折现模型的公式表述如下：P0=(E0CF1)/(1 +R)+(E0CF2)/(1 +R)2+...(延续到无限期)，其中P0代表某一企业、资产或工程的现值(当前价值)，E0CFn代表当前预测的未来第n期产生的自由现金流，R代表自由现金流的折现率。自由现金流贴现(DCF)模型是一种重要的公司估值方法，其定义为公司的价值等于公司在其剩余的生命周期中能够提供的自由现金流的现值之和。

萧飞羽左腕上的钢环转动得越来越快，显然是否接受天问大师的赌约他一时难以取舍。当他终于按住转动的钢环，目光却落在武成龙身上。武成龙似乎知道他企图进一步确定什么急忙传音：“语出无悔，承诺是金，天问大师和紫阳道长口碑更胜只手拿云。只是除了黑白双煞实力不为属下所知，其他人应战会有违三少收服天问大师和紫阳道长的初衷。”

为进一步探索LTB4R在AML肿瘤发生发展中的潜在功能，我们首先通过LinkedOmics数据库筛选出LTB4R共表达基因集合，包含多个免疫微环境、EMT转化、DNA损伤修复和能量代谢相关基因，反映了LTB4R对疾病调控分子网络的重要影响。运用GO和KEGG分析发现这些共表达基因富集到数条肿瘤相关的功能和信号通路，涉及免疫细胞分化、活化、吞噬功能和能量代谢。其次，我们基于LTB4R 表达水平将TCGA-LAML分组筛选出差异基因集合，GSEA分析显示这些差异基因功能主要富集到免疫细胞活化、分化，信号传导，免疫递呈，免疫反应，细胞因子信号通路。再次，通过与24种免疫细胞标志的相关性研究我们发现LTB4R 与肿瘤免疫浸润呈显著相关性。最后，通过STRING平台构建的PPI网络揭示了在AML肿瘤发生发展过程中与LTB4R功能密切相关的15个功能蛋白。以上结果显示LTB4R介导的信号通路与免疫微环境、能量代谢之间可能存在协同或交互作用。临床实验验证了生信分析的结论，LTB4R在AML患者中表达水平增高，并且与免疫检查点基因HAVCR2呈显著正相关，而受到样本量的影响，LTB4R与PDCD1表达相关性分析未显示统计学意义，扩增结果显示PDCD1扩增曲线CT值均在32左右，表明该基因在样本中表达量均较低，可能会掩盖组间表达差异，考虑下一步扩大样本量继续验证。

单项血清肿瘤标记物的灵敏度和特异度并不高，而联合检测的灵敏度和特异度分别达到了83.33%和97.50%。如下表2所示。

综上所述，本研究利用公共数据库综合分析了LTB4R在AML患者的特异性表达模式，评估了预后价值和临床特征相关性，进一步预测了其潜在功能，同时收集临床样本进行了实验验证。目前临床上采用的AML分型标准主要是FAB分型和WHO分型，前者主要基于形态学改变，后者侧重重现性遗传学异常。除M3 外，其他AML 分型的治疗方案区别不大，FLT3、IDH、NPM1的预后价值尚待进一步证实，靶向药物临床研究并未显示出患者显著获益。因此现有的AML临床预后风险评估策略尚需进一步优化。

LTB4R表达水平在AML患者，特别是在预后不良的高危亚组中显著升高，可作为肿瘤标志物和预后因素之一。TimeROC实验验证了LTB4R预后预测的特异性和灵敏性。多因素COX回归分析研究也证实纳入临床上现有的风险因素和预后指标，包括年龄、分型、细胞遗传学异常和预后基因后，LTB4R也是一个有效的独立预后基因。LTB4R可辅助临床进行AML疾病风险分层，并可能参与或协同肿瘤免疫、能量代谢等信号通路，在白血病发生中发挥重要作用。

临床实验验证选取了白血病原始细胞≥20%或＞2000/μL的AML外周血样本，可与TCGA、GEO数据集分析的结果相互验证、互为补充，有利于收集患者综合诊断和预后评估信息，受限于经济原因，并不是所有AML患者都能接受二代测序检查，本文证实LTB4R可采用外周血单个核细胞标本检测mRNA水平，外周血清/血浆检测蛋白水平，标本易于获得，临床实验室大多配备了分子诊断平台和免疫学实验流水线，有望开发检测试剂盒，便于临床应用。