HSP90α通过调控气道上皮细胞内质网应激加重屋尘螨诱导的哮喘气道炎症

支气管哮喘是一种常见的慢性、非传染性的异质性疾病，以慢性气道炎症为特点。随着城市化和生活方式改变，哮喘发病率逐年上升，应用糖皮质激素可控制气道炎症和高反应性，但该治疗伴随多种不良反应。哮喘的有效防治，是临床上亟待解决的难题。

哮喘是基因异质性与环境共同作用的结果，屋尘螨（HDM）是最常见的致敏原之一。致敏原引起气道上皮细胞受损、分泌炎症因子，营造气道炎症微环境，与哮喘的发生发展密切相关。关注气道上皮细胞对于寻找有效、精准的哮喘治疗具有重要意义。

热休克蛋白90（HSP90）作为一种损伤修复分子，发挥分子伴侣功能修饰客户蛋白底物，包括多种炎症相关蛋白。有研究表明HSP90诱导气道杯状细胞化生，在体内模型中导致气道炎症恶化，说明HSP90参与哮喘炎症，但其机制尚未清晰阐明。

在Th2型哮喘患者中，气道上皮细胞内质网应激水平增高，与临床症状严重性呈正相关，在哮喘小鼠模型中内质网应激标志物显著升高，提示内质网应激在哮喘炎症中具有重要作用。HSP90调节内质网蛋白功能，参与内质网转运，两者紧密相关，但其相关性在哮喘中尚无报道。

HSP90的亚型HSP90α调节细胞功能，在多种炎症中发挥重要作用，提示HSP90α在上述病理生理过程中可能扮演核心角色。

课题组前期研究已证实分泌型HSP90α诱导气道上皮屏障破坏，本研究聚焦于胞内HSP90α分子伴侣功能，首次关注哮喘中HSP90α与内质网应激的相关性与作用，进一步揭示哮喘炎症的机制。

1.2.4 Western blot 根据蛋白相对分子质量配制相应浓度（8%～12%）的PAGE胶，以120 V恒压电泳至染料到达胶的底部，以250 mA恒流转膜，转膜时间根据蛋白相对分子质量+30 min公式来计算，5%的BSA溶液封闭1 h，孵育相应的一抗稀释液8 h（兔抗HSP90α浓度为1∶1000，兔抗GAPDH浓度为1∶5000），孵育对应种属的二抗（二抗浓度为1∶10 000）2 h，Licor Odyssey显影仪显影，保存图像。

因此，本研究拟通过干预气道上皮细胞HSP90α探究在HDM诱导的哮喘模型中HSP90α是否通过内质网应激调控哮喘气道炎症，以期为哮喘的精准治疗提供新的研究方向。

1 材料和方法

1.1 材料

人气道上皮细胞株（HBE细胞，ATCC）；角质细胞培养基（KM培养基，ScienCell）；胎牛血清（GIBCO）；脂质体（Lipofectamine3000，Invitrogen）；Opti-MEM 减血清培养基（Invitrogen）；屋尘螨制剂（HDM，ALK-Abello）；坦螺旋霉素（17-AAG，Selleckchem）；内质网红色荧光探针（ER-Tracker Red），Hoechst 33342活细胞染色液（碧云天）；苏木素染液，伊红染液，瑞氏-姬萨姆复合染液（索莱宝）；白介素4（IL-4）、白介素5（IL-5）、白介素13（IL-13）Elisa试剂盒（Proteintech）；免疫组化兔二步法检测试剂盒（中国北京中杉金桥生物技术有限公司）；兔抗HSP90α多克隆抗体），兔抗磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）多克隆抗体（CST）；兔抗X盒结合蛋白1（XBP-1s）多克隆抗体，兔抗活化转录因子6α（ATF-6α）多克隆抗体，兔抗葡萄糖调节蛋白78（GRP-78）多克隆抗体（Proteintech）；驴抗兔红外二抗（Licor）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 HBE 细胞在KM 培养基中培养。HDM浓度梯度刺激分组如下：正常对照组；200 U/mL组：用HDM（200 U/mL）处理24 h；400 U/mL 组：用HDM（400 U/mL）处理24 h；800 U/mL 组：用HDM（800 U/mL）处理24 h。SiHSP90α干扰序列与17-AAG处理分组如下：正常对照组；HDM组：用HDM（800 U/mL）处理24 h，诱导哮喘体外模型；HDM+siHSP90α组：在HDM（800 U/mL）处理前用siHSP90α序列转染12 h；HDM+17-AAG组：在HDM（800 U/mL）处理前用17-AAG（900 nmol/L）预处理6 h；2 d/次更换培养基。

1.2.7.1 致敏 HDM及HDM+17-AAG组每只小鼠在Day0、Day7腹腔注射100µL的HDM混合液（4000 U/只，HDM40µL+PBS60µL）；正常对照组及17-AAG组对应注射100µL的PBS。

1.2.2 细胞转染 HBE细胞转染前1 d传代至6孔板，第2天细胞生长密度约50%～60%，用Lipofectamin3000进行siHSP90α序列（上海吉玛制药技术有限公司）转染，加入体积与siRNA为1∶1，转染终浓度为50 nmol。转染12 h后更换培养基，进行相关细胞实验。

1.2.1 细胞培养 将购买的人前列腺癌细胞PC3解冻复苏，接种于含10%胎牛血清DMEM培养基中，置于37℃、5% CO2的潮湿培养箱中培养，待细胞长满瓶底85%左右时，弃去培养液，加入胰蛋白酶消化处理后，进行传代培养和细胞冻存。

1.2.3 细胞内质网染色 HBE细胞传代铺于中皿中，按照实验设计处理后每皿加入200µL ER-Tracker Red工作液（1∶1000）孵育30 min，PBS清洗后每皿加入50µL Hoechst 33342活细胞染色液工作液（1∶100）孵育10 min后荧光显微镜拍照记录。

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1.2.12 免疫组织化学染色 取小鼠左侧肺脏，多聚甲醛固定、石蜡包埋、连续切片，经脱蜡、水化后封闭，孵育一抗8 h（XBP-1 1∶50,GRP-78 1∶50），在37 ℃下二抗孵育1 h，DAB显色、苏木素复染，透明后封片。

这种感觉终于迎来了验证的一天。在双方父母的一再催促下，我跟叶霭玲去领了结婚证。我明白这是一个极不靠谱的举措，但我实在找不出理由来拒绝叶霭玲。事实上，这个日子被我往后推了又推，以各种各样的理由，有些是完全站不住脚的。然后，它忽然呈现出不可动摇的面目，被选定在下一个吉日良辰。真是千挑万拣，实在没有办法再搪塞到下一次了。于是，我俩站在了结婚登记处的柜台前，面对一个胖胖的面目慈祥的女登记员，听她问，你愿意娶她为妻吗？我答，我愿。她又问，你愿意嫁给他吗？叶霭玲答，我愿意。然后登记员向我们收取了9元钱的登记费，给我们发了两份大红的结婚证书，打发我们走到阳光底下来。

1.2.6 琼脂糖凝胶电泳 配置2%的琼脂糖凝胶，上样后调电压至150 V，电泳20～30 min后停止电泳，取出凝胶后在BIO-RAD红外凝胶成像仪中显影。

1.2.7 动物造模 SPF级雄性C57BL/6小鼠36只，6～8周龄，体质量20～24 g，饲养于南方医科大学公共卫生学院清洁级动物房，随机分为4组，9只/组：正常对照组；17-AAG组；HDM组；HDM+17-AAG组。本实验经南方医院实验动物伦理委员会批准（NFYY-2021-1205）。

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1.2.7.2 激发 Day8在异氟烷吸入麻醉下，HDM处理组的小鼠每2 d 经气道滴注给药10µL HDM 混合液（400 U/只，HDM4 µL+PBS6 µL），总共激发10 次。HDM+17-AAG 组激发前进行17-AAG 混合液滴鼻（1µg/10µL），最后一次激发后的24 h内处死小鼠进行收样。

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1.2.8 肺泡灌洗液计数 将收集的肺泡灌洗液充分混匀，吸取10µL滴加到自动细胞计数板中，放入细胞计数仪内，调整相关参数，测得细胞总数后保存数据。

1.2.9 H&E染色 取小鼠左侧肺脏，多聚甲醛固定、石蜡包埋、连续切片，经脱蜡、水化后予苏木素+伊红染色后封片。

1.2.10 瑞氏-姬萨姆染色 收集小鼠肺泡灌洗液，重悬后滴于载玻片上，固定后使用瑞氏-姬萨姆染液染色后封片。

1.2.11 ELISA法 收集小鼠肺泡灌洗液，加样品到Elisa反应孔中，室温孵育2 h，洗板后加入酶标抗体，室温避光孵育2 h，洗板后加入显色底物，避光孵育30 min，终止反应后酶标仪上机检测发光度。

1.2.5 PCR 扩增 使用Trizol 法提取HBE 细胞的总RNA，取500 ng总RNA，使用TAKARA逆转录试剂盒逆转录为cDNA（10µL体系），根据Premix Taq™10µL+上游引物4µL+下游引物4µL+cDNA1.6µL+DEPC水7.6µL的体系进行扩增反应后保存，引物序列参考表1。

1.3 统计学分析

应用SPSS 19.0统计学软件，实验数据用均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，以＜0.05为差异有统计学意义，所有实验都是独立重复3次。

2 结果

2.1 在HDM 诱导的哮喘体外模型中，HBE 细胞的HSP90α与内质网应激标志物表达水平上调

在浓度梯度的HDM刺激下，与对照组相比，HDM浓度到200 U/mL 的浓度时，内质网探针即出现明显的强红色荧光（图1A）。HDM浓度达到400 U/mL及800 U/mL的浓度组中，HSP90α的mRNA表达水平变化无统计学意义（=0.218，图1B）；HDM 浓度达到800 U/mL时，HSP90α的蛋白表达水平出现显著上调（=0.011，图1B）。在HDM的刺激下，内质网应激标志物XBP-1（=0.044）、ATF-6α（=0.030）与GRP-78（=0.027）均出现表达水平显著上调（图1C）。

2.2 敲低HSP90α和使用HSP90 抑制剂17-AAG 抑制HBE细胞的内质网应激标志物的表达水平

相较于对照组，HDM 组的HSP90α、XBP-1、ATF-6α与GRP-78 出现表达上调（图2），与HDM 组相比，HDM+siHSP90α组中，HSP90α的表达显著下调，表明HSP90α被敲低（=0.048，图2A）。在HDM+siHSP90α组中，XBP-1（=0.008）表达出现下调，GRP-78（=0.077）表达变化无统计学意义，而ATF-6α在17-AAG处理下才出现下调（图2B）。

2.3 在HDM诱导的哮喘小鼠模型中，17-AAG抑制气道炎症水平

HDM滴鼻致敏及激发建立了炎症细胞聚集的哮喘模型，而17-AAG处理后，可以减少气道上皮细胞周围的炎症细胞聚集（图3A），同时减少肺泡灌洗液中的炎症细胞数（=0.014，图3B）。同样Elisa 提示在17-AAG处理后哮喘小鼠肺泡灌洗液中Th2炎症因子IL-4（=0.030）、IL-5（=0.035）显著下调，IL-13（=0.099）变化无统计学意义（图3C）。

2.4 在HDM诱导的哮喘小鼠模型中，17-AAG抑制气道上皮细胞的内质网应激标志物表达水平

在哮喘小鼠模型中，免疫组织化学染色结果提示，相较于对照组与17-AAG组，HDM组的气道上皮细胞中XBP-1与GRP-78的免疫组化染色明显加深，而在17-AAG处理后，XBP-1与GRP-78的免疫组化染色明显变浅（图4A）。

3 讨论

本研究通过HDM诱导的哮喘体外实验，发现HBE细胞分子HSP90α表达上调，证实HSP90α参与哮喘发生发展，与国外相关文献报道结果一致。已有报道表明HSP90α可修饰多种内质网应激相关蛋白，但在哮喘炎症中的作用尚未见报道。本研究围绕HSP90α对内质网应激蛋白修饰作用展开，我们发现，在HDM刺激下，HBE细胞出现内质网应激，内质网应激标志物表达上调，这进一步提示了两者之间的关联性。

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在本研究的体外实验中，敲低HSP90α基因及使用HSP90抑制剂17-AAG均可降低多种内质网应激标志蛋白的表达；而在体内实验中，气道滴注17-AAG可改善气道炎症水平，并降低气道上皮细胞的多种内质网应激标志蛋白水平。由此可见，HSP90与细胞内质网应激存在紧密的相关性，且HSP90α可能发挥角色作用。

内质网是一种特殊的细胞器，协调真核细胞蛋白质的合成、折叠和运输。当外界因素影响下，内质网正确折叠蛋白质的功能受到干扰，引起内质网应激，进一步激活细胞未折叠蛋白反应（UPR），若内质网应激持续存在或加重，UPR会诱导细胞凋亡。有研究报道，在过敏原刺激下，气道上皮细胞会发生UPR 诱导的凋亡，从而导致上皮屏障破坏，促进炎症因子释放，加重气道炎症，引起哮喘发作。而在本研究中首次发现，在哮喘中HSP90α是内质网应激蛋白重要的分子伴侣，当其受到抑制时可以缓解气道上皮细胞内质网应激，改善气道炎症。同时相关研究发现，哮喘患者外周血HSP90表达高于健康人群，提示HSP90α是一种有潜力的生物标志物。然而HSP90α是否直接影响，内质网应激从而减少UPR引起的气道上皮细胞细胞凋亡，进而改善气道炎症、延缓哮喘进程仍有待进一步研究。

综上所述，本研究通过体内、体外实验证明了HSP90α参与HDM诱导的哮喘气道炎症，并可能通过调控内质网应激这一通路实现；抑制HSP90α可改善上皮细胞内质网应激和气道炎症。因此，干预HSP90α可能成为治疗哮喘的新手段。