人工种植灯盏细辛总黄酮的提取工艺研究

王亚伦，杨允辉，朱站站，王天龙，李婧炜

(1 大理大学药学院，云南 大理 671000；2 云南白药集团大理药业有限责任公司，云南 大理 671000)

灯盏细辛又名灯盏花，为菊科植物短葶飞蓬的全草[1]，主要分布于我国西南部云南、四川、广西、贵州、西藏等地[2]。灯盏细辛具有散寒解表、祛风除湿、活血化瘀、通经活络、消炎止痛之功效。灯盏细辛中各类成分繁多，如黄酮、植物甾醇、挥发油、氨基酸及微量元素等[3]。药理学研究表明，通过浸渍法[4]、超声提取法[5]、组织破碎提取法[6]、碱水提取法[7]、回流提取法[8]等各种方法，从其中提取出的黄酮类化合物具有扩张脑血管、冠脉血管，改善微循[9-10]，抑制血小板凝集、抗凝血、抗心肌梗死[11]，防止脑缺氧及肾功能衰竭等多种药理作用[12-13]。灯盏细辛中黄酮类化合物是其主要成分，具有广泛的开发前景和利用价值，值得综合利用和加强资源开发[14]。

自灯盏细辛被研发成为药品后，其野生资源被大量采摘。一方面，客观的经济效益驱使着农户上山过度采摘，采挖时通常连根拔起，灯盏细辛的资源环境同时也遭到严重破坏，野生资源储备逐年递减。另一方面，收购价格不断上涨，企业生产成本增加。资源面临着枯竭，这势必影响灯盏细辛生物药品的大规模产业化生产。人工灯盏细辛种植技术势在必行[15]。

但是人工种植灯盏细辛与野生灯盏细辛相比，有几点不同。第一，生长环境。野生灯盏细辛生长环境不统一，如地势高低、潮湿程度、阳光照射程度以及土地肥沃程度等，这造成了药材质量难以控制。人工种植灯盏细辛则可避免这类问题。第二，人工因素影响。野生条件下，灯盏细辛生长状态不够稳定，除了生长环境的不一样，还有各种自然灾害或者虫类影响。人工种植的灯盏细辛在人为因素的保障下，产量质量能够进一步提高。第三，药材采收。野生灯盏细辛分布广，不够集中，采收人员复杂，并且采收之后药材的处理因人而异，不够统一，为了增加经济效益，一般连根拔起。这种情况使企业回收以及药材加工提高了难度。人工种植灯盏细辛统一采收并处理，只采收地上部分，而非全草。

由于各种因素的影响，野生药材与人工种植的药材在某些方面存在较大的差异。所以，在用于大生产时，人工种植与野生的灯盏细辛药材应有不同的提取工艺。

1 仪器、材料与试剂

1.1 仪 器

UV-2600紫外可见光分光光度计，岛津；AL104电子天平，上海梅特勒-托利多仪器有限公司；HHS21-8数显恒温水浴锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；GZX-9140 MBE电热干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

1.2 材 料

人工种植灯盏细辛干燥生药，云南白药大理药业提供，批号YP20191101、YP20191001M干燥生药。

1.3 试 剂

95%乙醇；总黄酮对照品芦丁(批号：100080-201811)，中国食品药品检定研究院；亚硝酸钠，国药集团化学试剂有限公司；氢氧化钠，国药集团化学试剂有限公司；硝酸铝，天津市风船化学试剂科技有限公司；所有化学试剂均为分析纯级，所有用水均为二次蒸馏水。

2 提取工艺的条件研究与筛选

2.1 理论依据

按照野生灯盏细辛的提取工艺为基准，预实验过后，在此基础上进行调整，确定考察因素及水平。

2.2 提取工艺优化

本实验方案将溶剂量、回流时间、乙醇浓度、提取次数设为四个考察因素，结合大生产条件，在三水平下比较对人工种植灯盏细辛总黄酮的得率。运用正交法[16]，观察实验结果，综合分析，选出最优组合。正交试验设计各因素水平表见表1。

表1 正交试验因素水平

根据因素水平表，选用L9(34)正交试验，见表2。

表2 乙醇回流提取工艺正交试验结果

2.3 供试品溶液的制备

人工种植灯盏细辛干燥生药100 g，按正交试验表所列条件90 ℃回流提取、过滤、挤压、合并提取液。提取液浓缩至浸膏后在烘箱进行8 h干燥，精密称取干燥浸膏粉末0.25 g，用60%乙醇溶解，置100 mL容量瓶中，加60%乙醇至刻度，摇匀即得。

2.4 总黄酮含量的测定

2.4.1 对照品溶液的制备

精密称取无水芦丁对照品20 mg，置100 mL量瓶中，加60%乙醇适量，必要时置水浴上微热使溶解，放冷，用60%乙醇稀释至刻度，摇匀，精密量取25 mL置50 mL量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，即得(每1 mL含无水芦丁0.1 mg)。

图1 提取流程图

2.4.2 标准曲线的制备[17]

精密吸取标准溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分别置10 mL容量瓶中，各加30%乙醇，定容至5.0 mL，精密加入50 mg/mL亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min，加100 mg/mL硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀，再放6 min，加氢氧化钠试液4.0 mL，再分别加水稀释至刻度，摇匀，放置15 min，用第一个容量瓶做空白，照紫外-可见分光光度法[18]，在 510 nm波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

2.4.3 测定法

精密吸取配置好的溶液0.4 mL，置10 mL容量瓶中，照标准曲线项下的方法自“各加30%乙醇使成5.0 mL，精密各加亚硝酸钠溶液” 起依法测定吸收度，从标准曲线上求出供试品中芦丁的重量(mg)，计算，即得。

2.5 最优条件工艺验证

以本研究优化的工艺条件，按2.3项下供试品溶液的制备法，按2.4项下测定法，计算总黄酮含量。重复三次，取平均值。

3 结 果

3. 1 标准曲线

以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线后，得回归方程：Y=12.9373X+0.0054，相关系数r=0.9998(n=6)。

3. 2 正交试验考察

回流提取工艺考察结果(见表2)，从极差直观分析结果，可看出人工种植灯盏细辛总黄酮乙醇回流提取的最佳提取工艺为 A3B3C2D3，即6倍量浓度为65%的乙醇，90 ℃下回流提取3次，每次提取2 h。从极差R值可以看出，影响总黄酮提取率的因素依次为：D>A>B>C，即提取次数>溶剂量> 回流时间>乙醇浓度。

3.3 最优工艺验证结果

在本研究优化的工艺条件下，重复三次，取平均值。人工种植灯盏细辛干燥生药总黄酮的得率为6.87%，通过换算，总黄酮含量为6.87%(RSD=1.66%)(即100 g灯盏细辛干燥生药中总黄酮含量为6.87 g左右)。以往研究显示，野生干燥药材中总黄酮含量都在5%左右[19-20]，相对于野生药材，人工种植灯盏细辛总黄酮绝对含量更高。

4 结 论

本研究采用 L9(34)正交试验对野生灯盏细辛总黄酮提取工艺进行调整，筛选了适合人工种植灯盏细辛的提取方案，即溶剂量为6倍，每次回流时间2 h，乙醇浓度65%，提取3次。在此条件下，总黄酮含量为药材的6.87%，验证了人工种植灯盏细辛总黄酮绝对含量远远高于野生灯盏细辛。但是人工药材提取浸膏中其他成分收率太高，导致浸膏中总黄酮百分含量反而比野生药材提取浸膏低，所以人工种植灯盏细辛提取浸膏需要经过一定的纯化才能运用于大生产。本文针对人工种植灯盏细辛药材进行提取工艺的筛选以及总黄酮有效成分含量进行了评估，为人工种植资源的进一步开发利用提供了科学依据。