猪圆环病毒2型Cap蛋白家蚕表达体系的构建与鉴定

郎洪武，陈晓春，刘 丹，韦永龙，李轶女，张志芳，杨汉春

(1.中国兽医药品监察所，北京 100081；2.中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081； 3.中国农业大学动物医学学院，北京 100094)

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2，PCV2)是20世纪90年代在病猪及一些无明显临床症状猪体内检测到的一种新型猪圆环病毒[1]。该病毒感染后会出现断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystetemic wasting syndrome,PMWS)、猪皮炎肾病综合征(Porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS)、猪呼吸系统混合疾病、繁殖障碍综合征等疾病。PCV2基因组全长1766个～1768个核苷酸，其中ORF2基因编码病毒的主要免疫壳蛋白Cap蛋白。该蛋白与病毒的致病性密切相关，通过改变病毒的宿主嗜性及病毒蛋白与细胞间的相互作用机制，可以使病毒获得不同的致病性[2-3]。Cap蛋白是PCV2主要免疫原性蛋白，能诱导机体产生中和抗体，因此Cap基因是PCV2基因工程疫苗及诊断试剂研制的主要候选基因[4]。此外，ORF2还常用于PCV2的流行病学分析[5]。

家蚕是繁殖昆虫杆状病毒并高效表达外源蛋白的生物反应器。近年用家蚕繁殖昆虫杆状病毒并表达外源蛋白这一技术，在动物疾病的疫苗和治疗药物等研究领域得到了很多应用[6]。日本国家动物卫生研究所用BmNPV体系生产的宠物(猫和犬)预防重组IL制剂已由日本“TORAY”株式会社生产并投入市场。中国农业科学院生物技术研究所与中国科学院生化技术研究所合作，1990年首次用家蚕杆状病毒系统表达了人乙型肝炎病毒表面抗原。中国农业科学院生物技术研究所与兰州兽医研究所合作，用家蚕生物反应器生产口蹄疫空衣壳病毒颗粒基因工程疫苗和狂犬病基因工程疫苗于2008年-2009年分别获得了农业部遗传工程安委会颁发的安全生产证书和在全国8个省市可以销售的销售证书。本文用家蚕表达PCV2的Cap蛋白，以期为PCV2基因工程疫苗及诊断试剂的研制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒和抗体 PCV2-1株、PCV2-2株、PCV2-3株、PCV2-4株、PCV2-5株、PCV2-6株，由中国兽医药品监察所病毒制品检测室分离鉴定和保存。病毒AcNPV、BmNPV，由中国农业科学院生物技术研究所实验室提供；PCV2 Cap蛋白多克隆抗体由中国兽医药品监察所病毒制品检测室制备和保存。

1.1.2 载体试剂和实验动物 pET-28a、昆虫转移载体pVL1393、家蚕品种JY1由中国农业科学院生物技术研究所实验室提供；TC-100细胞培养基干粉和胎牛血清，Sigma公司产品；LipofectamineTM2 000，Invitrogen公司产品；DL 2 000 Plus DNA Marker，全式金生物公司产品；BglⅡ、BamHⅠ和PstⅠ等内切酶，NEB公司产品产品。

1.1.3 主要仪器与设备 PCR仪、核酸电泳仪，Bio-Rad公司产品；微量移液器，Eppendorf公司产品；倒置显微镜，Nikon公司产品；酶标仪，Molecular Devices公司产品；CO2细胞培养箱和透射电子显微镜，Thermo公司产品。

1.2 方法

1.2.1 PCV2Cap基因的克隆 将PCV2-1株、PCV2-2株、PCV2-3株、PCV2-4株、PCV2-5株和PCV2-6株，用表1的引物扩增Cap基因ORF2的序列，连接至pMD18T载体，将鉴定正确的阳性克隆分别命名为pMD18T-Cap1、pMD18T-Cap2、pMD18T-Cap3、pMD18T-Cap4、pMD18T-Cap5、pMD18T-Cap6。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1 Cap基因扩增引物序列

1.2.2 重组杆状病毒转移载体的构建 将pMD18T-Cap1-6和杆状病毒转移载体pVL1393质粒分别进行双酶切，胶回收后进行重组杆状病毒转移载体的构建。正确的重组质粒命名为pVL(cap1)、pVL(cap2)、pVL(cap3)、pVL(cap4)、pVL(cap5)、pVL(cap6)。

1.2.3 重组杆状病毒的获得 将线性化的Bm NPV-ZJ8病毒DNA和pVLcap1-6质粒DNA共转染至约含0.5×106～1×106个Bm-N细胞的15 cm2培养瓶中，27℃培养4 d～5 d，至细胞浮起后，收集上清液用于重组病毒的筛选、纯化和扩增。

提取rBmNPVcapX的基因组DNA，利用PCR方法分析外源基因整合：参照多角体基因启动子序列在ATG上游40 bp处设计一条引物，polh-F:5′-ACTGTTTTCGTAACAGTTTTGTAA-3′，以提取的病毒基因组DNA为模板，进行PCR反应。鉴定是否得到了重组病毒rBmNPVcapX。

1.2.4 Cap蛋白在家蚕中的表达 将重组病毒培养液按每条105pfu注射五龄幼蚕，待家蚕发病后，剪掉足，收集蚕血，置-20℃冻存。包被液作为空白对照，以正常蚕血作为阴性对照，实验室制备的Cap蛋白多克隆抗体为一抗，HRP标记的羊抗兔抗体为二抗。用ELISA法检测Cap抗原基因在蚕体中的表达情况。

1.2.5 人工改造Cap7基因的表达与鉴定 设计下述引物：cap2-5F：5′-GAAAAATGGCATCTTCAA CGCCCGCCTCTC-3′和cap2-5R：5′-GAGAGGCG-GGCGTTGAAGATGCCATTTTTC-3′。以Cap5基因的DNA为模板，用cap5F与cap2-5R进行PCR扩增；用cap2-5F与cap2R以Cap2基因DNA为模板进行PCR扩增。最后用cap5F和cap2R作为引物，将相应的PCR扩增产物纯化后共同作为模板进行融合PCR扩增，扩增产物克隆到T载体，测序验证命名为Cap7。

将人工改造的Cap7基因克隆到转移载体pVL1393中，得pVL(Cap7)。pVL(Cap7)DNA与亲本病毒DNA在昆虫细胞中进行共转染，经筛查、纯化得重组病毒rBmNPV(Cap7)，将rBmNPV(Cap7)按同样方法感染家蚕，取血淋巴，进行ELISA检测，并与商品化空衣壳PCV疫苗对照，计算每粒蚕蛹的空衣壳表达量。

将家蚕中含Cap7表达产物的一粒蚕蛹的匀浆液，经超声波破碎，15 000 r/min离心10 min去细胞碎片，上清用270 000 r/min在400 g/L蔗糖密度中离心6 h，所得的沉淀溶于1 mm无菌水中，经电镜观察PCV2病毒粒子状态。

1.2.6 家蚕表达PCV2空衣壳电镜观察结果 将家蚕中含Cap7表达产物的一粒蚕蛹的匀浆液，经超声波破碎，15 000 r/min离心10 min去细胞碎片，上清用270 000 r/min在400 g/L蔗糖溶液中离心6 h，所得的沉淀溶于1 mm无菌水中，电镜观察PCV-2病毒粒子状态。

2 结果

2.1 不同毒株Cap基因的氨基酸序列比较

猪圆环病毒株PCV2-1、PCV2-2、PCV2-3、PCV2-4、PCV2-5和PCV2-6共6个Cap基因推测的氨基酸序列分析结果表明，PCV2-1、PCV2-3、PCV2-4、和PCV2-6的ORF2基因的片段长度均为705 bp，编码234个氨基酸。PCV2-2和PCV2-5的ORF2基因的长度均为702 bp，编码233个氨基酸。6个毒株的Cap基因推导的氨基酸序列相似性为86.75%～100%(图1)。

图1 6个不同毒株的Cap基因推测的氨基酸序列的比较

2.2 不同毒株Cap蛋白在家蚕中的表达及分析

用制备的Cap蛋白多克隆抗体作为一抗，HRP标记的羊抗兔抗体为二抗，通过ELISA检测不同重组病毒家蚕中Cap的表达。结果表明Cap基因在家蚕中得到了高量的表达，其中rBmNPV(Cap5)和rBmNPV(Cap2)表达量相对较高(图2)。

1～6.Cap1～Cap6的蛋白表达量 1-6.rBmNPV(Cap1-Cap6)

比较6个Cap基因的氨基酸序列，Cap1-4和Cap6的核定位信号序列基本一致，Cap5的突变位点为F8Y，R12K，S17I和V30D，推测这可能是引起Cap5高表达的特征性氨基酸。排除核定位信号序列，Cap2的其他氨基酸与Cap5相比只有第47位和59位不同，分别为T47A和R59A，推测是Cap2高表达的特征性氨基酸。如果将Cap2和Cap5基因进行改造，将核定位信号中的高效表达氨基酸8Y，12K，17I和30D与编码序列中47A和59A通过PCR方法集中在一个Cap基因中，则可能获得表达效率更高的Cap基因。

2.3 人工改造基因Cap7基因的序列测定

根据Cap1-6蛋白表达量的差异和Cap1-6氨基酸序列比较，通过融合PCR方法得到改造的Cap基因Cap7，Cap7基因的长度均为702 bp，编码233个氨基酸。Cap7基因推导的氨基酸序列与PCV2-5的ORF2氨基酸序列相似性最高，只有2个氨基酸的差异，氨基酸相似性为99.14%(基因序列具体测定结果见表2)。

2.4 人工改造的Cap基因在家蚕中的表达

取表达了Cap7的家蚕淋巴液，经ELISA检测，Cap蛋白的表达量是Cap5的5.3倍，这充分说明8Y、12K、17I、30D、47A和59A等特征性氨基酸是高效表达和组装圆环病毒空衣壳粒子所必须的。用每毫升含20μg/L的商品化空衣壳PCV2疫苗作为阳性对照，计算可得每粒蚕蛹或每毫升蚕血淋巴的空衣壳表达量为1.2 mg～1.6 mg。

2.5 家蚕表达PCV2空衣壳电镜观察结果

家蚕中含Cap7蛋白表达产物的蚕蛹匀浆液纯化后，经电镜观察，病毒粒子已经完全纯化(图3)。

2.6 免疫电镜结果

蚕蛹经超离纯化后，可得1.2 mg～1.6 mg的猪圆环病毒空衣壳，图4为40倍稀释后的免疫金标记电镜图(200 000×)，金粒大小为10 nm。

表2 人工改造基因Cap7序列测定结果

图3 家蚕生物反应器中高表达的病毒空衣壳粒子

图4 家蚕表达Cap蛋白形成的病毒空衣壳免疫电镜图

3 讨论

核衣壳蛋白是猪圆环病毒的结构蛋白，该蛋白具有较好的免疫原性，开发该蛋白作为疫苗，防治猪圆环病毒病具有良好的效果[7-8]。用杆状病毒表达ORF2，能够折叠成类病毒颗粒，很好地保留了其免疫原性[9-10]。目前，已有包括德国勃林格殷格翰动物保健公司的PCV2疫苗和荷兰英特威、先灵葆雅动物保健公司的PCV2疫苗等用杆状病毒表达的PCV2的Capsid作为疫苗。由于这些疫苗用昆虫培养细胞来生产，成本高，价格昂贵，限制了其应用和推广。

用家蚕杆状病毒表达ORF2比用sf9细胞表达能大大降低生产成本，家蚕在中国历来就有入药和食用的传统，表达产物也无需纯化就可以作为口服疫苗使用。本研究在家蚕杆状病毒中表达的ORF2不带任何标签，只能通过抗体来检测其表达状况，需要构建ORF2的原核表达载体，在大肠埃希氏菌中表达去核定位信号的ORF2，纯化制备多抗，检测蚕血中的核衣壳蛋白表达，家蚕血中可以检测到大量特异的PCV2衣壳蛋白。