高癌家系气虚质鼻咽癌患者鼻咽组织标本RhoGDIβ的表达水平及其临床病理意义*

刘 湘 肖红云 陈舒华

1 广东省佛山市第二人民医院 528000； 2 邵阳市中心医院

鼻咽癌是指恶性肿瘤位置位于鼻咽腔顶部或侧壁的疾病类型，恶性肿瘤发病类型统计中，在我国该类癌症属于高发性癌症类型[1]。临床治疗过程中发现，由于其病理学特征及疾病位置的特殊性，放疗是首选的治疗办法。但是在治疗过程中的临床观测情况了解可知，单纯的放射治疗对早期鼻咽癌有良好的治疗效果，但对病情发展到一定程度的鼻咽癌临床疗效并不理想，而且会带来严重的放射治疗损伤作用[2]。研究发现鼻咽癌高癌家系与遗传存在密切关联，且高癌家系鼻咽癌患者多表现为气虚质、复合质和失调热质，而散发性鼻咽癌表现为复合质和气虚质[3]。有研究发现Annexin A7和RhoGDIβ的表达与多种肿瘤的发生和发展有明显关联[4]。中医中鼻咽癌属于“气虚染毒”，此学说已在动物实验中验证，但临床实验报道较少，因此本文对高癌家系气虚质鼻咽癌组织中的RhoGDIβ进行鉴定，观察其特定病理意义及蛋白质组分RhoGDIβ的变化。

1 材料与方法

1.1 实验标本 选取2019年11月—2020年11月我院耳鼻咽喉科高癌家系气虚质鼻咽癌组织标本、散发气虚质鼻咽癌组织标本和正常组织标本，每组标本各收集6例。纳入者资料完整，且高癌家系中确定两代人中有3个以上家族成员患癌症，2个以上患鼻咽癌。纳入者均未接受过放化疗和均无淋巴结转移，且未分化非角化性鳞状细胞癌；依据2008鼻咽癌分期标准确诊[5]。初诊鼻咽癌患者年龄在18～69岁，无严重系统性疾病和传染病，精神意识正常，非月经期，排除哺乳期和孕期者。鼻咽组织取出放入-80℃冰箱保存。

1.2 实验方法 应用oligo7.0软件和参照相关文献进行设计引物，采用BLAST检索确认引物的特异性，并使用BioEdit软件进行序列分析比较，RhoGDIβ引物序列：F:5’-GACTTCCTTCCTGTTCTAACTGC-3’，R:5’-CAGTGCTTCACGTCTCTGTCC-3’，产物长度82bp；β-actin引物序列：F:5’-ACCGGAACGGAGCTATGAAC-3’，R:5’-ATCCCACTGGACTCAATGCC-3’，产物长度116bp。

1.3 检测方法 实验使用的离心管均经无菌无酶处理，匀浆器物品使用0.1%的DEPC溶液进行浸泡37℃过夜，并于126℃下灭菌30min，总RNA提取根据RNeasy MiniKit试剂盒说明严格操作。逆转录CADNA：参照Thermo Scientific RevertAid Firt Stran cDNA Synthesis Kit试剂盒进行严格操作。将试剂盒中各组组分混匀离心，离心后放于冰上，在放置于冰上无菌无核核酸酶的PCR管中。PCR反应液配置参照SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒说明进行操作，反应体系为25μl，操作时均在冰上进行充分混匀试剂。Westernm blotting法：将总蛋白提取，每组称重100mg，加入预冷蛋白裂解液1ml，放于冰上玻璃匀浆器中匀浆至透明无颗粒后分别转移至预冷的1.5ml的EP管，4℃，10 000r/min离心5min，转移至上清液并重新预冷至1.5ml EP管中，放于-80℃下保存。BCA法蛋白：根据BCA试剂盒说明操作，并采用蛋白标准曲线检测蛋白浓度。Westernm blotting蛋白免疫印迹结果分析采用Alpha View SA凝胶图像进行分析，并分析其光密度值，观察蛋白光度值与内参光度值的比值，并判断目的蛋白的含量。

2 结果

2.1 RhoGDIβ Real Time PCR检测结果 Real Time PCR分析表达使用2-ΔΔCt值相对量法推算样本中RhoGDIβcDNAd的模板起始量，内参基因使用β-actin；将正常鼻咽组织设为正常组，观察高癌家系和散发气虚质鼻咽癌组中RhoGDIβ的基因表达情况。结果显示高癌家系鼻咽癌组中的RhoGDIβ表达量是正常组的0.88倍和3.01倍，而散发性鼻咽癌组的RhoGDIβ表达无明显变化。采用单因素方差分析正常组RhoGDIβ基因表达与散发性鼻咽癌组比较差异无统计学意义(P>0.05)；正常组与高癌家系鼻咽癌组比较差异有统计学意义(P<0.01)；高癌家系鼻咽癌组与散发性鼻咽癌组比较差异有统计学意义(P<0.01)。见表1～2、图1～2。

表1 观察3组RhoGDIβ mRNA的表达差异

图1 RhoGDIβ mRNA在正常组、散发性鼻咽癌组及高癌家系鼻咽癌组中的表达情况

表2 观察3组RhoGDIβ mRNA相对表达

图2 RhoGDIβ mRNA在正常组、散发性鼻咽癌组及高癌家系鼻咽癌组中的相对表达

2.2 Western blotting检测结果 采用兔抗人RhoGDIβ抗体作为1抗，β-actin作为内参蛋白，对3组中的RhoGDIβ蛋白表达进行检测，检测显示内参蛋白β-actin在3组鼻咽组织中均有表达(P>0.05)，见图3。RhoGDIβ蛋白与β-actin的OD比较发现，正常组RhoGDIβ蛋白相对表达量为1.01±0.28，散发性鼻咽癌组为0.29±0.18，高癌家系鼻咽癌组为3.15±1.13，3组蛋白表达结果经方差分析比较差异具有统计学意义(F=18.110，P=0.000<0.01)。组间两两比较显示，正常组高于散发性鼻咽癌组(P=0.011)，但低于高癌家系鼻咽癌组(P=0.015)散发性鼻咽癌组低于高癌家系鼻咽癌组(P=0.006)。即高癌家系鼻咽癌组织中表达明显上调，而散发性鼻咽癌组则下调。见图4。

图3 RhoGDIβ蛋白Western blotting蛋白免疫印迹结果

图4 RhoGDIβ蛋白在正常组、散发性鼻咽癌组及高癌家系鼻咽癌组中的相对表达

3 讨论

研究发现早期采用蛋白组学鉴定高癌家系鼻咽癌组织中的RhoGDIβ蛋白表达较其他蛋白质表达更加明显，但蛋白组学法自身存在明显不足[6-7]。有研究发现气虚体质与鼻咽癌的发生和发展存在明显关联，且RhoGDIβ与癌细胞的生长、分化、发生、发展和转移等存在密切关联[8-9]。RhoGDIβ可能属于癌基因的产物，可能受抑癌基因和癌基因的调控，或通过某种方式而激活癌基因[10-11]。目前关于RhoGDIβ蛋白表达的情况多于细胞转移、淋巴组织的分布和细胞凋亡等有关，且实验证实RhoGDI2可持续性激活Racl/cdc42GTPases，从而起到促进细胞转移[12-13]。研究显示RhoGDIβ蛋白可促进胃癌细胞的生长和发展，且RhoGDI2过表达癌细胞中的B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)的基因明显上调，Bcl-2在RhoGDI2过表达中对顺铂的耐药性起到了中介作用[14-15]。RhoGDIβ蛋白不仅在胃癌中有表达，在结直肠癌、膀胱癌和乳腺癌中均有表达。

本文通过PCR检测RhoGDIβ在散发气虚质鼻咽癌和高癌家系气虚质鼻咽癌组织中的表达情况，显示RhoGDIβRNA在高癌家系组中的表达明显较正常组和散发性鼻咽癌组上调，而正常组与散发性鼻咽癌组经比较差异无统计学意义(P>0.05)，本研究认为可能与散发性鼻咽癌组中的RhoGDIβ表达对人体无影响，且推测散发性鼻咽癌组中的RhoGDIβ受Etsl的调节，从而表现出了双重作用，最终导致RhoGDIβ表达与正常组无明显差异。本文发现，RhoGDIβ RNA在高癌家系气虚质鼻咽癌组织中的表达明显上调，而根据相关文献研究发现高癌家系气虚质鼻咽癌组织中可能存在遗传缺陷，加上气虚可能对DNA有明显影响，导致损伤修复基因发生变化。Western blotting法检测发现RhoGDIβ可能与高癌家系气虚质鼻咽癌患者存在明显正相关性，发现RhoGDI2的高表达促进了高癌家系气虚质鼻咽癌患者的发生和发展。研究发现RhoGDI2蛋白促进了CRC细胞增殖和转移，部分通过信号通路激活了PI3K/AKt。研究提示检测鼻咽癌组织中RhoGDIβ的表达情况可能对早期诊断和分子靶向治疗起到了重要意义。

综上所述，实验证实RhoGDIβ属于本课题早期鉴定出的表达蛋白，在高癌家系气虚鼻咽癌患者中RhoGDIβ存在明显高表达作用，可作为早期诊断和筛查的重要标记物。