microRNA在HBV感染和致病中的作用研究进展
2022-04-07贾晓兰傅占江代晓朋
张 坦,贾晓兰,曹 丽,杨 明,傅占江,代晓朋
HBV感染是一个全球性的公共卫生问题。全球有约20亿人感染过HBV,慢性HBV携带者超过2.5亿,每年约80万患者死于HBV相关的疾病[1]。慢性HBV感染导致免疫介导的肝损伤和癌变,最终可发展为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)。据报道,虽然疫苗接种有效降低了新生儿HBV感染率,但如果不采取干预措施,2015—2030年将累计将出现6300万例新的慢性HBV感染者和1700万例HBV相关死亡病例[2]。干扰素和核苷酸/核苷类似物等药物可抑制HBV复制并缓解肝脏病变,但停药后病毒易复发、长时间用药可导致病毒耐药突变和其他不良反应等限制了治疗效果,并且无法彻底根除患者体内的HBV cccDNA[3]。目前,HBV在人肝细胞中建立持续感染和致病的分子机制尚不清楚,通过寻找新的HBV感染和致病靶点,开发耐受性更好的治疗策略,对于治疗和预防HBV感染和致病至关重要。
微 小 RNA(microRNA, miRNA) 是 由19~23个核苷酸组成的小的非编码RNA,通过与目标转录本的3’-非翻译区(untranslated regions, UTR)配对,抑制翻译和/或降解mRNA,进而调节基因表达,在细胞增殖、分化、癌变、抗病毒等多种生物过程中发挥重要作用[4]。
miRNA是HBV-宿主相互作用的重要调节因子,参与了HBV感染、复制和HBV相关疾病的调节[5]。人体内的miRNA可通过直接与HBV转录本结合影响HBV复制,或通过靶向与HBV生命周期相关的细胞因子间接影响HBV复制。反之,HBV感染可导致细胞miRNA表达水平的变化,这些miRNA参与调节在HBV致病中起关键作用的细胞基因和信号通路,在HBV致病中发挥重要作用。
1 宿主细胞miRNA调控HBV复制和表达
1.1 直接抑制HBV复制和表达 宿主细胞的miRNA可以直接与HBV转录本结合进而抑制HBV复制和表达。Zhang等[6]首先发现了能够直接靶向HBV转录本的miRNA,他们在HepG2.2.15细胞中通过功能缺失的方法,分别敲除328个miRNA,发现miR-199a-3p和miR-210可有效降低HBV复制和HBsAg表达水平。通过生物信息学分析显示,miR-199a-3p和miR-210分别通过直接靶向HBV基因组的HBsAg编码区和前S1区,进而抑制HBV复制和表达。Potenza等[7]研究发现,miR-125a-5 p的种子序列与HBV表面抗原的编码序列互补配对,抑制病毒表达,从而减少HBsAg分泌量,进而还可能抑制HBV复制。后续研究还发现许多与癌症相关的miRNA,包括miR-15a/miR-16-1[8]、miR-20a 及 miR-92a-1[9]、miR-1236[10]都可以直接与HBV mRNA互补配对并抑制HBV复制和表达。在HBV的研究中发现,肝脏表达丰度最高且具有肝脏特异性的miR-122可通过碱基互补配对靶向HBV聚合酶mRNA和核心蛋白mRNA的3’-UTR,抑制HBV复制和表达,临床试验进一步表明,HBV阳性患者体内miR-122水平与外周血单个核细胞中的病毒载量呈负相关,表明miR-122可抑制HBV复制,导致HBV的持续/慢性感染[11]。
1.2 间接抑制HBV复制和表达 某些宿主细胞的miRNA虽然在HBV基因组中没有直接的结合位点,但可以通过靶向其他宿主因子,通过作用于启动子和增强子而间接调节HBV复制。HBV的转录主要受4个启动子(即核心、前S1、前S2/S和X启动子)和2个增强子(ENI和ENII)的调节,它们在HBV复制中起着关键作用[12]。核因子I(nuclear factor I, NFI)是一种位点特异性的DNA结合蛋白,由NFIA、NFIB、NFIC、NFIX 4种蛋白转录因子组成,可以特异性结合HBV增强子和启动子,影响HBV复制[13]。NFIA可直接调节HBV增强子I活性来促进HBV复制。Fan等[14]研究发现,miR-370可以靶向抑制NFIA,降低HBV增强I/C启动子活性,进而抑制HBV复制和表达。富含半胱氨酸和组氨酸的结构域1(cysteine- and histidine-rich domain containing 1,CHORDC1)是一种热休克蛋白,能够通过促进HBV启动子/增强子的活性而促进HBV的复制和表达。Zhao等[15]研究发现miR-26b通过直接抑制CHORDC1的表达而抑制HBV增强子/启动子活性,抑制HBV转录、基因表达和复制。过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferatoractivated receptor, PPAR) 由 PPARA、PPARB和PPARC组成,是属于核激素受体超家族的配体激活转录因子[16]。PPARA与HBV基因组前RNA合成和病毒复制相关,在HBV核心启动子、前S1启动子、X启动子、ENI和ENII都含有PPARA结合位点,PPARA可反式激活HBV启动子和增强子[17]。Hu等[18]研究发现,miR-141通过直接与PPARA mRNA 3’-UTR结合抑制PPARA表达,降低HBV启动子和增强子转录活性,进而抑制HBV的复制和表达。此外,miR-29c通过靶向肿瘤坏死因子α诱导蛋白3降低S1启动子活性[19],miR-185-5p通过直接靶向调节转录因子1抑制S1启动子活性[20],从而最终抑制HBV的复制和表达。肝脏的富含的转录因子和核受体可以结合HBV启动子/增强子元件,并在激活和调节HBV转录中起关键作用,miRNA通过调控转录活性的转录因子,间接调节HBV复制和表达。
1.3 促进HBV复制与表达 目前尚无miRNA直接靶向HBV促进病毒复制其复制和表达的报道,某些miRNA可通过靶向宿主基因促进HBV复制和表达。HBx相互作用蛋白(hepatitis B X-interacting protein, HBXIP)是一种与HBx蛋白结合的人类蛋白,可通过与HBx相互作用来降低 HBV复制。miR-501通过靶向抑制HBXIP表达,增强HBV复制[21]。活化的STAT 2蛋白抑制剂(protein inhibitor of activated STAT 2, PIAS2)是转录蛋白的信号转导和激活剂,通过阻断转录因子与DNA的相互作用来调节基因表达。在HBV感染中,PIAS2可抑制HBV复制和表达。miR-137能够靶向抑制PIAS2表达,进而促进HBV的复制和表达[22]。干扰素介导的抗病毒作用是细胞对病毒感染反应的重要组成部分。miRNA-548可以直接靶向并抑制干扰素-λ1的表达,调节宿主抗病毒反应,有助于HBV感染和复制[23]。以上促进HBV复制的miRNA,大多是通过调控宿主体内影响HBV复制的负性细胞调节因子的模式发挥作用。
miRNA通过靶向HBV自身的调节因子促进HBV复制和表达。NFIB是一种下调HBV增强子I和核心启动子活性的转录因子。miR-372/373能够直接靶向抑制NFIB的表达,增强HBV增强子I和核心启动子活性,进而促进HBV表达[24]。SMARCE1是染色质重塑复合物家族的成员,在转录调控中发挥关键作用。在HBV感染中,SMARCE1通过与HBV核心启动子结合抑制HBV的表达和复制[25-26]。miR-802和miR-29a都可以通过靶向抑制SMARCE1,促进HBV核心启动子活性,进而促进HBV复制和表达[25-27]。E盒结合锌指蛋白2(E-box binding zinc finger protein 2,ZEB2)是ZEB转录因子家族的一个成员,在参与肿瘤发生的TGF-β/BMP通路中发挥重要作用。在HBV感染中,ZEB2通过靶向抑制HBV核心启动而抑制HBV的复制和表达[28]。miR-146可以直接靶向抑制ZEB2的表达,提高HBV核心启动子的活性,进而促进HBV的复制和表达[29]。此外,miR-15b[30],miR-1[31]等都是通过间接调节HBV启动子和增强子活性促进HBV的复制和表达。
miRNA还可在表观遗传学水平上调控HBV的复制和表达。HBV cccDNA的甲基化和去乙酰化等表观遗传修饰,通过调控HBV cccDNA转录为mRNA,在控制HBV复制中发挥关键作用。组蛋白的乙酰化和去乙酰化是基因表达调控的重要机制,组蛋白的乙酰化促进转录,而组蛋白的去乙酰化抑制转录,这一过程主要由组蛋白乙酰化转移酶和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)调节。HDAC4调节HBV cccDNA结合组蛋白的去乙酰化,抑制HBV的转录和表达。miR-1和miRNA-548ah通过直接与HDAC4结合抑制HBV cccDNA结合组蛋白的去乙酰化,提高HBV cccDNA转录,进而促进HBV的复制和表达[31-32]。
miRNA还可通过调节肝细胞的自噬,影响HBV的复制和表达。自噬参与先天免疫系统对病原微生物的识别,有利于病原体的吞噬和清除。研究表明,在HCC细胞系中通过抑制中的Akt/mTOR信号通路可以增强肝细胞自噬,从而正向调节HBV复制。Wang等[33]发现miR-192-3p可通过靶向X连锁的凋亡抑制蛋白调节NF-κB信号通路,进而刺激细胞自噬,促进HBV复制和转录。锌指蛋白143(zinc finger protein 143, ZNF143)是一种调节细胞周期相关基因的转录激活因子。Li等[34]研究发现,HBV感染者血清miR-192-3p水平与HBV DNA和HBsAg水平呈正相关,进一步的分子机制研究表明,miR-192-3p通过靶向HepG2细胞中ZNF143来抑制Akt/mTOR信号通路增强细胞自噬,从而促进HBV复制和转录。miR-155可以靶向细胞因子信号抑制因子(suppressor of cytokine signaling, SOCS)1抑制Akt/mTOR信号通路,刺激细胞自噬,从而促进HBV的复制与表达[35]。此外,miR-146a-5p介导的MDM2/p53轴在自噬过程的起始阶段诱导肝细胞的自噬,进而促进HBV复制[36]。
2 宿主细胞miRNA参与HBV致病
慢性HBV感染可导致肝炎、肝硬化,甚至HCC,这一复杂过程涉及肝细胞反复破坏和再生等多种遗传和表观遗传变化,在这些改变中,miRNA异常表达起着至关重要的作用。
2.1 miRNA与肝脏炎症 HBV是一种非致细胞病变病毒,HBV感染引起宿主免疫反应,导致肝脏炎症。miRNA在HBV所致的肝脏炎症中发挥重要作用。Li等[37]研究发现,HBx通过NF-κB信号通路促进先天免疫相关miR-146a的表达,补体因子H(complement factor H, CFH)是补体激活替代途径的重要负性调节因子,miR-146a靶向抑制CFH表达,促进导致 肝脏炎症。HBx-miR-146a-CFH-补体激活调节通路介导了HBV感染所导致的肝脏炎症。HBeAg通过PI3K和NF-κB信号通路促进巨噬细胞中miR-155的表达,增加的miR-155通过抑制BCL-6、SHIP-1和SOCS-1的表达促进炎性细胞因子的产生[38]。此外,研究发现miR-122、miR-132在肝脏炎症相关的先天性和适应性免疫中具有重要功能[39],同时也受HBV的调控,在HBV所介导的肝脏炎症中的作用及机制需要进一步的深入研究。
2.2 miRNA与HBV相关的肝纤维化和肝硬化 HBV感染产生的细胞外间质不平衡引起持续性炎症,进而导致肝纤维化。肝星状细胞(hematopoietic stem cell, HSC)是肝纤维化相关的主要效应因子。Guo等[40]鉴定了在HSC激活过程中差异表达的miRNA,发现miRNA通过不同的信号通路参与HSC激活,在肝脏纤维化过程中发挥重要作用。研究发现,母亲信号蛋白同源物7(drosophila mothers against decapentaplegic protein 7,Smad7)表达的缺失或抑制与组织纤维化、炎性疾病以及肿瘤等密切相关[41]。Huang等[42]研究发现,慢性HBV感染导致肝星状细胞HSC miR-33a水平升高,miR-33a通过直接靶向抑制Smad7的表达,促进肝纤维化的进展。
2.3 miRNA与HBV相关HCC HCC是最常见的恶性肿瘤之一,在亚洲90%的HCC是由HBV感染引起。尽管在HBV相关HCC的早期诊断和治疗方法方面已取得显著进展,但是HBV促进HCC发展的详细分子机制仍不清楚。研究发现,miRNA可作为癌基因或抑癌基因在HBV相关HCC发生中起重要作用。Li等[43]对与HBV和HCV相关HCC患者的血清进行测序,发现13个miRNAs在HBV相关HCC病例中存在表达差异,可以准确区分HBV携带者、HCV携带者和健康者,其中miR-375和miR-92a具有HBV特异性。miR-122是肝脏中含量最高的miRNA,占肝脏总miRNAs含量的70%。N-myc下游调节基因3(N-myc downstream-regulated gene, NDRG3)是一种肿瘤激活因子,导致肿瘤的恶性表现,在HBV相关HCC的临床肿瘤标本和表达HBV抗原的HepG2.2.15细胞系中均高表达。研究发现,miR-122抑制了NDRG3的转录和表达,从而逆转了肿瘤细胞的恶性表型,其通过靶向NDRG3在HBV相关的HCC发生中发挥重要作用[44]。在另一项研究中,HBV感染导致miR-122水平降低,促进垂体瘤转化基因结合因子的过度表达,进而促进了HCC细胞的生长和侵袭[45]。此外,miR-122表达降低与细胞周期蛋白G1的上调有关,它促进了鼠双微基因2(一种p53的阻遏蛋白)的去磷酸化,并导致HCC细胞的增殖[46]。研究发现,在HBV感染中,参与抑制细胞增殖的miRNAs(miR-15 b、miR-22、miR-26a/b、miR-29c、miR-145 和 miR-199-a-3 p)在HBV相关HCC中表达下调,而一些癌基因样miRNAs(miR-17-92簇和miR-21、miR-181a、miR-143、miR-602)在HBV相关HCC中表达上调,这些异常表达的miRNAs在促进HCC过程中发挥重要作用[47]。
2.4 HBV编码miRNA与HBV致病 2017年,Yang等[48]首次发现一种HBV编码miRNA—HBV-miR-3,其在HBV感染的组织和细胞中高表达。在HBV感染患者体内,HBV-miR-3通过外泌体和HBV病毒粒子释放到血液循环中,HBV-miR-3的表达水平与HBV感染急性期患者血清中的HBV载量呈正相关,HBV-miR-3可通过抑制HBV转录而抑制HBV的复制,表明HBV编码的miRNA在HBV感染过程中,通过调节HBV转录本来控制自我复制。这种负反馈调节可能有助于解释HBV感染如何导致肝细胞轻度损伤和维持持续感染的情况。进一步的研究发现,HBV-miR-3可以调节宿主基因表达[49]。SOCS5是HBV-miR-3的直接靶点,SOCS5的其下调可以激活STAT1,导致HBV感染HCC细胞中干扰素激活基因转录增强,促进干扰素的抗病毒作用;HBV-miR-3通过SOCS5/STAT1途径还可促进巨噬细胞M1极化。Yao等[50]发现了另一种HBV编码的miRNA——HBV-miR-2。HBV-miR-2通过直接靶向抑制TRIM35的表达和上调RAN表达,抑制细胞凋亡和增强上皮间质转化,促进迁移和侵袭,从而促进HCC细胞增殖。HBV编码miRNA的发现有助于深入理解HBV的感染和致病机制,为HBV感染的诊断和治疗提供新的靶点和生物标志物。
3 小 结
miRNA在宿主-病毒相互作用中起关键作用。细胞miRNA可以通过直接结合HBV转录物或通过靶向与HBV生命周期相关的细胞因子,调节HBV转录和复制。反过来,HBV感染可改变细胞miRNA水平。HBV编码的miRNA还可调节病毒感染状态和病毒生命周期。
随着我们对miRNA的研究不断深入,HBV对细胞miRNA的影响以及miRNA在HBV感染和HBV相关HCC的发展过程中所起的作用将逐渐清晰。在肝病的不同临床阶段,血清/血浆中miRNA表达谱的改变为miRNA作为非侵入性生物标记物的应用开辟了新的视角。
在临床应用方面,目前广泛用于抗病毒治疗的核苷/核苷酸类似物以及大多数细胞因子药物其作用机理主要在HBV RNA转录后起作用抑制病毒复制,不直接影响其基因表达;而miRNA在转录水平上控制HBV,同时限制HBV复制和基因表达。因此,在HBV感染治疗策略上基于miRNA的治疗具有很好的前景,是HCC治疗的潜在生物靶点。