GeneXpert MTB/RIF检测技术在肺结核诊断及利福平耐药分析中的应用研究

胡晓蓉，宋江勤

全球结核病患病率高，社会负担重，我国是位列全球第二的结核病高负担国家。WHO全球结核病报告显示，2020年全球病原学阳性证据率为58%，我国为55%，低于全球水平，误诊和漏诊率较高[1]。传统的痰涂片、痰培养、传统核酸扩增等方法周期较长。目前综合医院逐渐将快速分子生物学方法如GeneXpert MTB/RIF检测法作为涂片的替代方法用于结核病及耐药结核病病原学检查的首选方法，而且也作为诊断结核病的金标准之一[1]。本研究分析了GeneXpert MTB/RIF检测技术在肺结核诊断中的应用，现报告如下。

1 对象与方法

1.1 对象 本研究为回顾性分析，收集2020年7月—2021年6月在天门市第一人民医院就诊疑似肺结核患者120例作为研究对象，其中男性患者59例，女性患者61例，年龄在29～59岁，平均年龄为（44.29±2.67）岁，体质量指数平均为（24.58±2.06）kg/m2。所有患者均签署知情同意书，并经我院伦理委员会论证通过。患者入选标准：①所有研究对象均诊疑似肺结核进我院治疗；②所有患者均知情同意。排除标准：①合并自身免疫性疾病；②合并肿瘤疾病；③合并精神异常患者。

1.2 方法 所有患者均留取呼吸道痰标本，进行痰涂片、痰培养、GeneXpert MTB/RIF检测及比例法药物敏感试验（药敏试验）。GeneXpert MTB/RIF试剂盒购自美国Cepheid公司。

痰涂片：参照《中国结核病防治规划痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》[2]萋-尼抗酸染色要求操作，并按照文献规定的光学显微镜报告标准进行报告。

痰培养：罗氏固体培养法按照《结核病诊断细菌学检验规程》[3]对痰标本进行前期处理、固体培养操作。将患者的痰液接种到罗氏培养基，置于37 ℃培养箱中孵育。每周观察结果并报告阳性结果，若满8周仍未有菌落生长，则报告培养阴性。

GeneXpert MTB/RIF检测：按照GeneXpert MTB/RIF试剂盒操作手册进行操作。取患者的痰液标本1 ml，向其中加入2 ml的样本处理液，剧烈振荡20次，或涡旋振荡10 s，室温孵育10 min，再重复振荡10 s，室温孵育5 min，使用新的移液管，将2 ml经过处理的样本加入GeneXpert MTB/RIF反应盒中进行反应，反应时间为2 h，观察结果。

比例法药敏试验：用接种环取培养基或痰涂片上的菌落，研磨后与标准麦氏管比对，制成1 mg/ml菌悬液，接种到含利福平的罗氏固体培养基和空白对照管培养基，37 ℃培养4周后观察结果。

1.3 观察指标 计算Xpert MTB/RIF检测MTB的诊断效能。灵敏度=真阳性病例数/（真阳性病例数+假阴性病例数）×100%；特异度=真阴性病例数/（真阴性病例数+假阳性病例数）×100%；一致率=（真阳性病例数+真阴性病例数）/总病例数。

1.4 统计学处理 数据分析采用SPSS 22.0软件进行统计分析，计算GeneXpert MTB/RIF检测MTB的灵敏度和特异度；并计算GeneXpert MTB/RIF检测与固体培养法、比例法药敏试验结果的一致率。

2 结 果

2.1 一般情况 120例疑似肺结核患者经检测，痰涂片阳性42例（35.00%），痰涂片阴性78例（65.00%）；痰涂片阴性患者中最后确诊为肺部肿瘤、肺炎、支气管扩张者7例。42例痰涂片阳性患者中，3例GeneXpert MTB/RIF检测MTB结果为无效，无效率为7.14%。78例痰涂片阴性患者中，7例GeneXpert MTB/RIF检测MTB结果为无效。最终可进行GeneXpert MTB/RIF检测者110例；其中痰涂片阴性患者中3例GeneXpert MTB/RIF检测利福平耐药结果无法判断，即最终可进行对比分析者107例。

2.2 GeneXpert MTB/RIF诊断肺结核的效能 107例疑似肺结核患者中，痰培养MTB阳性48例，其中GeneXpert MTB/RIF检测MTB阳性41例；痰培养MTB阴性59例，其中GeneXpert MTB/RIF检测MTB阴性52例。以痰培养结果为金标准，GeneXpert MTB/RIF检测MTB的灵敏度为85.42%（41/48），特异度为88.14%（52/59）。GeneXpert MTB/RIF与痰培养诊断一致率为86.92%（93/107）。见表1。

表1 痰培养与GeneXpert MTB/RIF检测MTB结果（例）Table 1 Results of sputum culture MTB and GeneXpert MTB/RIF detection MTB (cases)

进行GeneXpert MTB/RIF检测107例疑似肺结核患者中，痰涂片阳性39例（36.45%），痰涂片阴性68例（63.55%）。以痰培养结果为金标准，痰涂片阳性患者中，GeneXpert MTB/RIF检测MTB的灵敏度为97.22%（35/36），特异度为33.33%（1/3）（表2）；痰涂片阴性患者中，GeneXpert MTB/RIF检测MTB的灵敏度为50.00%（6/12），特异度为91.07%（51/56）（表3）。

表2 痰涂片阳性患者痰培养与GeneXpert MTB/RIF检测MTB结果（例）Table 2 Results of sputum culture and GeneXpert MTB/RIF detection in sputum smear positive patients (cases)

表3 痰涂片阴性患者痰培养与GeneXpert MTB/RIF检测MTB结果（例）Table 3 Results of sputum culture and GeneXpert MTB/RIF detection in sputum smear negative patients (cases)

2.3 GeneXpert MTB/RIF药敏试验检测效能 比例法药敏试验确认痰培养阳性36例患者中利福平耐药者有4例（11.11%），敏感者有32例（88.89%）。以比例法药敏结果为金标准，GeneXpert MTB/RIF检测痰培养阳性患者利福平耐药的灵敏度为75.00%（3/4），特异度为93.75%（30/32）。同时，对GeneXpert MTB/RIF与比例法药敏试验进行一致性检验，一致率为91.67%（33/36），2者具有较好的一致性。见表4。

表4 GeneXpert MTB/RIF药敏试验与比例法药敏试验结果（例）Table 4 Results of GeneXpert MTB/RIF drug sensitivity test and proportional drug sensitivity test (cases)

3 讨 论

GeneXpert MTB/RIF系统是一种能够快速诊断结核病并检测结核杆菌耐药性的全新系统，该系统主要针对MTB的位于RpoB基因81 bp区域（密码子426—452）的利福平耐药突变区（该区域被称为利福平耐药决定区）设定引物、探针并进行扩增检测，并根据其是否发生基因突变而确定被检测样本中是否含有MTB，而且也能检测其是否对利福平耐药[4]。该系统能够对样本进行全自动的核酸提取、纯化及浓缩，而且2 h便可出结果，是全自动的半定量巢式实时聚合酶链反应，具有更高的灵敏度和特异度，而且该系统的检测过程是在完全封闭的检测盒中进行的，因此该方法不仅具有操作简单、高度全自动化的优点，而且还有很好的生物安全性。该技术已被WHO和我国推荐作为用于快速诊断成人和儿童肺结核和肺外结核以及利福平耐药，具有确诊的作用[1]。

本研究结果显示，以痰培养结果为金标准，GeneXpert MTB/RIF检测TBM的灵敏度为85.42%，特异度为88.14%，GeneXpert MTB/RIF与痰培养诊断一致率为86.92%。这与国内其他同行研究结果一致[1，4]。因此GeneXpert MTB/RIF检测技术可有效的筛检出肺结核阳性患者，且具备快速便捷的特征，弥补痰培养周期长的缺陷。值得注意的是，本研究所纳入的107例患者为疑似肺结核病例，患者标本的低质量或者弱阳性均会使得GeneXpert MTB/RIF检测技术出现弱信号，从而得出错误的结论。同时，本研究对2种方法分析结果不一的病例进行分析，发现多数病例存在临床特征不明显、采集样本较少的现象，这可能导致了GeneXpert检测技术结果的误判。

本研究进一步分析了GeneXpert MTB/RIF检测技术分别在痰涂片阳性和阴性患者中对肺结核的诊断价值，结果显示，痰涂片阳性患者中，GeneXpert MTB/RIF检测MTB的灵敏度为97.22%，特异度为33.33%；痰涂片阴性患者中，GeneXpert MTB/RIF检测MTB的灵敏度为50.00%，特异度为91.07%。这说明了人群发病率或病原体感染率的高低对某一诊断技术灵敏度和特异度的影响，即人群发病率越高，该诊断技术灵敏度越高，特异度越低，反之则灵敏度越低，特异度越高[5]。

在对患者的GeneXpert MTB/RIF检查中，主要是将标本的处理、DNA提取以及核酸扩增等工作集于一体，在对患者进行病原微生物检测过程中，及时有效对患者的耐药基因进行检测，在实际的检测过程中，通过多通道的检测，一般可在2 h之内即可得到结果。在整个检测过程中，其较高的封闭性以及自动化，在临床检测中的外部影响较小，降低手动操作中可能的误差，提升检测的准确性[6]。

本研究显示，以比例法药敏结果为金标准，GeneXpert MTB/RIF检测痰培养阳性患者利福平耐药的灵敏度为75.00%，特异度为93.75%，对GeneXpert MTB/RIF与比例法药敏试验进行一致性检验，一致率为91.67%（33/36），2者具有较好的一致性。这与国内研究结果一致[1]。RpoB基因中的81bp耐药基因的突变是造成肺结核患者利福平耐药的重要原因。本研究将GeneXpert MTB/RIF中加入利福平耐药的基因片段检测试剂，将RpoB基因作为利福平耐药检测的靶基因，在检测中，使用引物探针对RpoB基因中的81bp片段进行选择性覆盖，通过其检测的阳性与否，进一步对患者的耐药情况进行分析[7-8]。

综上，本研究发现GeneXpert MTB/RIF检测MTB有较高的灵敏度和特异度，对于利福平耐药的检测与比例法药敏试验有较高的一致性，可以作为结核病诊断和利福平耐药检测的金标准。但是本研究还存在一定的局限性，由于纳入的样本量较少，研究数据需要大样本量进一步支持。