寻常型银屑病患者皮损组织中miR-145-5p、MLK3表达变化及意义

吴佳理，张磊，肖玉凤

贵阳市第二人民医院皮肤科，贵阳550081

摘要：目的 探讨寻常型银屑病（PV）患者皮损组织中微小RNA（miR）-145-5p、混合谱系酶3（MLK3）表达及意义。方法 选取78 例PV 患者，根据 病情严重程度分为轻度组（n=31）、中度组（n=28）、重度组（n=19）。采用RT-qPCR 检测皮损组织和相邻非皮损组织中miR-145-5p 和MLK3、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、干扰素-γ（IFN-γ）、白细胞介素-2（IL-2）、IL-17 mRNA 表达。采用免疫组化法检测皮损组织和相邻非皮损组织中MLK3 蛋白阳性表达率。比较不同病情严重程度PV 患者皮损组织中miR-145-5p 和MLK3、TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-17 mRNA 表达。Pearson法分析PV 患者皮损组织中miR-145-5p、MLK3 mRNA 表达与TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-17 mRNA 表达的相关性。结果 与非皮损组织比较，皮损 组织中miR-145-5p、IL-10 mRNA 表达降低，MLK3、TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-17 mRNA 表达升高（t分别为21.552、18.539、28.414、8.540、26.356、15.010、11.952，P 均＜0.01）。轻度组、中度组、重度组皮损组织中miR-145-5p、IL-10 mRNA表达依次降低，MLK3、TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-17 mRNA表达依次升高（P均＜0.01）。与非皮损组织比较，皮损 组织中MLK3蛋白阳性表达率升高，重度 组MLK3蛋白阳性表达率高于轻度组、中度组，中度 组MLK3蛋白阳性表达率高于轻度组（P均＜0.01）。Pearson相关性分析显示，PV患者皮损组织中miR-145-5p表达与MLK3、TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-17 mRNA 表达呈负相关（r分别为-0.627、-0.433、-0.546、-0.499、-0.502，P均＜0.01），与IL-10 mRNA表达呈正相关（r=0.652，P＜0.01）；MLK3与TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-17 mRNA表达呈正相关（r分别为0.620、0.595、0.556、0.597，P均＜0.01），与IL-10 mRNA表达呈负相关（r=-0.733，P＜0.01）。结论 PV患者皮损组织中miR-145-5p低表达，MLK3 mRNA高表达；检测二者表达有助于病情判断。

关键词：寻常型银屑病；炎症；微小RNA-145-5p；混合谱系酶3

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2022.10.009

中图分类号：R246.7文献标志码：A文章编号：1002-266X（2022）10-0039-05

银屑病是一种免疫相关的慢性复发性炎症性皮肤疾病，典型皮损表现为鳞屑性红斑或斑块，局部或广泛分布。寻常型银屑病（PV）指点滴状和斑块状银屑病，占所有银屑病的95%以上［1-2］。目前银屑病的治疗目的仍以控制、稳定病情，减缓发展进程，减轻瘙痒症状和皮损加重为主，尚无特效治疗方法，复发率高，其病理生理机制仍是研究热点。慢性炎症参与PV 发生、发展［3］。微小RNAs（miRNAs）是一类短链非编码小RNA，能在转录后水平上负向调控靶基因表达，在银屑病发生、发展中发挥重要作用［4-5］。研究报道，miR-145-5p 与类风湿关节炎、脓毒症、神经炎症等免疫炎症相关疾病相关［6-8］。混合谱系酶3（MLK3）是丝苏氨酸蛋白激酶家族一员，亦称丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶11（MAP3K11），参与调控多种信号通路，在多种免疫炎症相关疾病中发挥重要作用［9］。miRNA 靶基因预测发现，miR-145-5p 与MLK3 存在结合位点，但关于二者与PV 病情严重程度和炎症因子的相关性尚不明确。为此，我们对PV患者皮损组织中miR-145-5p、MLK3 表达及意义进行了探讨。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2020 年1 月—2021 年7 月贵阳市第二人民医院收治的78 例PV 患者，外科手术方式收集患者表皮皮损组织和相邻非皮损组织，部分以10%中性甲醛溶液固定，常规脱水、透明、浸染、石蜡包埋、切片后进行免疫组化检测，剩余部分置于-196 ℃液氮中冻存后进行RT-qPCR 检测。其中男44 例、女34 例，年龄27～68（38.44±5.28）岁；病程4 个月～9 年。纳入标准：①PV 符合《中国银屑病诊疗指南（2018完整版）》［3］诊断标准；②临床资料完整；③患者及家属均知情研究，并签署同意书。排除标准：①合并其他皮肤疾病；②体表创伤；③近2周接受过抗银屑病治疗；③免疫系统损害；④妊娠及哺乳期妇女；⑤合并重要脏器功能损害；⑥合并严重感染；⑦近3 个月内使用光疗、生物制剂、钙调磷酸酶抑制剂类、维A酸类药物史；⑧恶性肿瘤。本研究经医院伦理委员会审核通过。

1.2 PV 皮损组织和非皮损组织中miR-145-5p、MLK3 mRNA 和炎症因子表达检测 采用RT-qPCR法。取出冻存组织，碾碎后加入TRIzol试剂（北京柏莱斯特科技发展有限公司，生产批号：LGTZ001）提取组织总RNA，NanoDrop 2000C 超微量分光光度计测RNA 浓度和纯度，使OD260/OD280为1.8～2.0，Ta-KaRa 试剂盒（北京智杰方远科技有限公司，生产批号：RR036A）转录合成cDNA，使用RT-qPCR 试剂盒（宝日医生物技术有限公司，生产批号：638315）和MiniAmp PCR 仪（赛默飞世尔科技有限公司）进行RT-qPCR 扩增。反应体系20µL：2×All-in-one qPCR Mix 10 µL、正向引物2 µL、反向引物2 µL、模板cDNA 2µL、ddH2O 4µL。热循环反应参数：95 ℃预变性10 min 循环1 次，95 ℃变性10 s、63 ℃退火20 s、72 ℃延伸10 s循环40次，反应结束后得到各反应管Ct，采用2-ΔΔCt法计算组织中miR-145-5p 和MLK3、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、干扰素γ（IFN-γ）、白细胞介素-2（IL-2）、IL-17 mRNA 的相对表达量，实验重复3次，取平均值。RT-qPCR 引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成，其中miR-145-5p 以U6 作内参，MLK3、TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-17 以GAPDH 作内参。miR-145-5p 正向引物：5′-CAGTCTTGTCCAGTTTTCCCAG-3′，反向引物：5′-TATGCTTGTTCTCGTCTCTGTGTGTC-3′；U6 正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；MLK3 正向引物：5′-CATGCCACTCGACTTCAAGC-3′，反向引物：5′-AGACGTTTCTCCTCCGGTCA-3′；TNF-α 正向引物：5′-TGTTCCTCAGCCTCTTCTCCTT-3′，反向引物：5′-CTCTCAGCTCCACGCCATTG-3′；IFN-γ 正向引物：5′-TCCCATGGGTTGTGTGTTTA-3′，反向引物：5′-TCCCATGGGTTGTGTGTTTA-3′；IL-2 正向引物：5′-ATCTGTACCTGTCCTGCGTGTTG-3′，反向引物：5′-TTCTGCTTGAGAGGTGCTGATGT-3′；IL-10 正向引物：5′-CTTCGGTCCAGTTGCCTTCTC-3′，反向引物：5′-AGGTGAGTGGCTGTCTGTGT-3′；IL-17 正向引物：5′-TCTCAGCTCCACGCCATTG-3′，反向引物：5′-CCACGGACACCAGTATCTTCTC-3′；GAPDH 正向引物：5′-AACTTTGGGATTGTGGAAGG-3′，反向引物：5′-ACACATTGGGGGTAGGAACA-3′。

1.3 银屑病严重程度分级 PV 患者入院后根据《中国银屑病诊疗指南（2018完整版）》［3］以体表受累面积（BSA）、银屑病皮损面积和严重程度指数（PASI）、皮肤病生活质量指数（DLQI）进行病情严重程度分级。轻度：BSA＜3%，PASI＜3，DLQI＜6；中度：BSA 3%～＜10%，PASI 3～＜10，DLQI 6～＜10；重度：BSA≥10%，PASI≥10，DLQI≥10。根据病情严重程度将PV 患者分为轻度组（n=31）、中度组（n=28）、重度组（n=19）。

1.4 PV 皮损组织和非皮损组织中MLK3 蛋白表达检测 采用免疫组化法。组织切片常规脱蜡、复水、苏木素-伊红染色、脱水，将载玻片置于65 ℃环境下孵育45 min 后脱蜡，柠檬酸盐缓冲液和3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶以检索抗原，非特异性抗原阻断后，载玻片与兔抗人MLK3 抗体（杭州联科美讯生物医药技术有限公司，生产批号：2817S）在4 ℃环境下孵育过夜。次日将载玻片与HRP 标记的二抗（赛默飞世尔科技有限公司，生产批号：B40952）在室温下孵育1 h。DAB显色试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，生产批号：P0203-1）显色，蔡司光学显微镜（德国蔡司，型号：Carl Zeiss）观察显色程度，苏木精复染，根据染色强度和阳性细胞数计算免疫组化评分。染色强度：棕褐色（3 分）、棕黄色（2分）、淡黄色（1 分）、无色（0 分）；阳性细胞率（随机5个高倍视野，阳性细胞数占总细胞数比例）：≥75%（4分）、50%～＜75%（3 分）、25%～＜50%（2 分）、1%～＜25%（分）。免疫组化评分=染色强度×阳性细胞率，二者乘积≥2表示阳性。

1.5 统计学方法 采用SPSS27.0 统计软件。计数资料以例（%）表示，比较采用χ2检验；计量资料经Shapiro-Wilk检验符合正态分布，以-x±s表示，两组比较采用独立样本t检验，多组间比较行ANOVA趋势检验，组间两两比较Bonferroni校正；Pearson分析PV患者皮损组织中miR-145-5p、MLK3 mRNA与炎症因子的相关性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PV 皮损组织和非皮损组织中miR-145-5p、MLK3 mRNA 和炎症因子表达比较 PV 皮损组织中miR-145-5p、IL-10 mRNA 表达低于非皮损组织，MLK3、TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-17 mRNA 表达高于非皮损组织（P＜0.01）。见表1。

表1 PV皮损组织和非皮损组织中miR-145-5p、MLK3 mRNA和炎症因子表达比较（-x±s）

2.2 不同病情严重程度PV 患者皮损组织中miR-145-5p、MLK3 mRNA 和炎症因子表达比较 轻度组、中度组、重度组皮损组织中miR-145-5p 表达依次降低，MLK3、TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-17 mRNA 表达依次升高（P均＜0.01）。见表2。

表2 不同病情严重程度PV患者皮损组织中miR-145-5p、MLK3 mRNA和炎症因子表达比较（-x±s）

2.3 PV 皮损组织和非皮损组织及不同病情严重程度PV 患者皮损组织中MLK3 蛋白阳性表达率比较 皮损组织中MLK3 蛋白阳性表达率66.67%（52/78）高于非皮损组织39.74%（31/78），差异有统计学意义（χ2=11.354，P＜0.01）。轻度组、中度组、重度组MLK3 蛋白阳性表达率分别为54.84%（14/31）、71.43%（20/28）、94.74%（18/19），重度组MLK3 蛋白阳性表达率高于轻度组、中度组，中度组MLK3 蛋白阳性表达率高于轻度组（χ2=15.356，P＜0.01）。

2.4 PV 患者皮损组织中miR-145-5p、MLK3 mRNA与炎症因子的相关性 Pearson相关性分析显示，PV患者皮损组织中miR-145-5p 表达与MLK3、TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-17 mRNA 表达呈负相关（r分别为-0.627、-0.433、-0.546、-0.499、-0.502，P均＜0.01），与IL-10 mRNA 表达呈正相关（r=0.652，P＜0.01）；MLK3与TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-17 mRNA表达呈正相关（r分别为0.620、0.595、0.556、0.597，P均＜0.01），与IL-10 mRNA 表达呈负相关（r=-0.733，P＜0.01）。

3 讨论

银屑病俗称“牛皮癣”，是由免疫应答异常、环境诱因、遗传背景等因素相互作用导致软骨细胞、关节滑膜细胞的炎症反应或角质形成细胞异常增殖而发病，不仅会引起皮肤局部或广泛鳞屑或斑块，还可合并关节、内脏损害、心血管疾病等其他系统异常，常罹患终身，尚无治愈方法，严重影响患者心理和生理健康［10］。进一步探索银屑病的病理生理机制对控制病情和维持长期疗效有重要意义。

目前研究认为，银屑病细胞炎症反应和过度增殖是以T 淋巴细胞介导为主，多种免疫细胞共同参与的过程，T 淋巴细胞在聚集于银屑病皮损前就处于异常活化状态，浸润表皮或真皮层后可促进银屑病进一步发展［11］。既往认为，PV 是“Th1 型”炎症性疾病，细胞因子以TNF-α、IFN-γ、IL-2 增加为主。近年研究认为，Th17 炎症细胞IL-17 数量增加和Treg抗炎细胞IL-10数量减少，导致Th17/Treg失衡在PV中发挥重要作用［12-13］。miRNAs 是一类内源性长18～25 个核苷酸的非编码单链小分子RNA，主要通过结合靶基因3′-非翻译区，降解靶mRNA或阻碍靶蛋白翻译，从而调控靶基因表达。大量研究报道其在银屑病中发挥重要作用，如miR-489-3p 能靶向抑制Toll 样受体4/核因子-κB（NF-κB）信号通路，进而抑制银屑病细胞增殖和炎症反应［14］。miR-145-5p定位于人染色体5q32，王鸿利等［15］实验发现，上调miR-145-5p表达能靶向双特异性磷酸酶6缓解脂多糖诱导的血管内皮细胞炎症反应。TANG 等［16］实验发现，上调miR-145-5p 表达能靶向Pvt1 抑制类风湿性关节炎组织炎症反应。上述研究提示，miR-145-5p在炎症反应中发挥重要抑制作用。本研究结果显示，与在非皮损组织中比较，PV 皮损组织中miR-145-5p 表达降低，且轻度组、中度组、重度组皮损组织中miR-145-5p 表达依次降低，提示miR-145-5p 低表达参与PV 发生、发展。进一步分析发现，PV 患者皮损组织中miR-145-5p 表达与TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-17 mRNA 表达呈负相关，与IL-10 mRNA 表达呈正相关，提示miR-145-5p 低表达可能通过调控炎症反应参与PV 的发生、发展，但其机制有待进一步研究。

PV 的慢性炎症反应与NF-κB、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）等多条信号通路激活有关［17-18］。MLK3定位于人染色体11q13.1，是MAPK 家族的上游调控信号分子，在T 细胞中大量表达，其高表达与NFκB 和MAPK 信号通路激活有关［19］。WANG 等［20］研究报道，MLK3 高表达可通过NF-κB/含NLR 家族Pyrin 域蛋白3 信号通路增强心肌炎症反应。ZHANG 等［21］研究报道，抑制MLK3 表达能通过MAPK 信号通路显著减少神经炎症。上述研究提示，MLK3 在炎症反应中发挥重要作用。本研究结果显示，与在非皮损组织中比较，PV 皮损组织中MLK3 mRNA 表达和蛋白阳性表达率升高，且轻度组、中度组、重度组皮损组织中MLK3 mRNA 表达和蛋白阳性表达率依次升高，提示MLK3 mRNA 高表达参与PV 发生发展。进一步分析发现，PV 患者皮损组织中MLK3 mRNA 表达与TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-17 mRNA 表达呈正相关，与IL-10 mRNA 表达呈负相关，提示MLK3 mRNA 过表达可能通过调控炎症参与PV 发生发展，其机制可能与MLK3 能激活NF-κB、MAPK 信号通路增强炎症反应有关。本研究结果还显示，PV患者皮损组织中miR-145-5p表达与MLK3 mRNA 表达呈负相关，提示二者可能通过相互作用调节PV 炎症反应。YAN 等［22］通过双荧光素酶报告基因实验证实，miR-145-5p 能靶向下调MLK3 抑制银屑病角质化细胞增殖和NF-κB 信号通路激活，减轻银屑病皮肤炎症，与既往研究相符。

综上所述，PV患者皮损组织中miR-145-5p低表达，MLK3 mRNA 高表达；检测二者表达有助于病情判断。但本研究为单中心小样本量研究，可能存在选择偏倚，同时miR-145-5p、MLK3 参与PV 的机制还需进一步研究。