黄芪水煎剂对流感病毒感染Raw264.7细胞的保护作用及机制

梁羽茜，王如峰，黄松丽，张秋艳，刘晓燕，胡秀华

(北京中医药大学,北京 100029)

课题组前期实验发现黄芪注射液可通过调控TLR3信号通路保护流感病毒感染的Raw264.7细胞[1]。本次研究选择了不同黄芪剂型，即黄芪水煎剂(Astragalus decoction，AD)进行后续实验，重点探讨AD对流感病毒的作用及机制，为其临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1病毒株 亚洲甲型鼠肺适应株 A/FM/1/47(H1N1)由中国预防医学科学院病毒学研究所提供。据Reed & Muench法得出流感病毒的TCID50为10-3.62/0.1mL。

1.1.2试剂与仪器 中药黄芪购自北京同仁堂股份有限公司(批号：20111302)，经传统中药煎煮法煎煮而成；CO2细胞培养箱(BINDER，德国)，酶标仪(Bio-Tek，美国)。

1.2 方法

1.2.1细胞培养与分组 小鼠Raw264.7细胞购自北京协和医学院细胞资源中心，按照1 ∶3～1 ∶5的比例传代培养。实验分为正常组(Normal组)、加药组(AD组)、病毒对照组(Virus组)、病毒加药组(Virus+AD)。

1.2.2细胞增殖实验 Raw264.7细胞Normal组加入细胞培养液，AD组加入含药细胞培养液，培养24 h、48 h、72h后检测OD值，计算药物IC0、IC10、IC25剂量用于后续实验。

1.2.3抗流感病毒活性 Raw264.7细胞Normal组、Virus组、Virus+AD组进行相应病毒感染及加药处理后培养72 h，检测OD值。

1.2.4流式细胞术检测细胞周期 Raw264.7细胞各组进行相应处理后培养72h收集细胞。固定、染色后，检测并分析细胞增殖周期。

1.2.5超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)及丙二醛(malondialdehyde，MDA)测定 使用SOD及MDA检测试剂盒，按照说明书操作，并计算各组细胞内SOD及MDA值。

1.2.6Western blot测定TLR3信号通路相关蛋白表达 提取各组蛋白并测定浓度。蛋白变性定量后电泳，电转至PVDF膜孵育一抗、二抗，曝光显影后分析目的条带。

2 结果

2.1 AD对Raw264.7细胞增殖的影响AD对Raw264.7细胞的增殖具有抑制作用，且呈时间和剂量依赖性。统计软件计算出72 h相应IC0、IC10及IC25为0.2 g·L-1、1.6 g·L-1、5 g·L-1。

2.2 AD改善流感病毒感染Raw264.7细胞的增殖能力如Tab 1所示，与Virus组相比，0.2 g·L-1AD干预72 h后可降低病毒对细胞增殖的抑制作用(P<0.01)。

Tab 1 Results of anti-influenza virus activities of AD for 72 h n=4)

2.3 AD改善流感病毒所致的Raw264.7细胞G1期阻滞如Tab 2所示，与Virus组相比，Virus+AD组G1期细胞百分比降低(P<0.01)，S期细胞百分比升高(P<0.01)。

Tab 2 Effects of AD on cell cycle of Raw264.7 n=3 )

2.4 AD对细胞内SOD、MDA的影响与Virus组相比，0.2 g·L-1AD干预可使流感病毒感染后细胞内SOD升高(P<0.01)，MDA降低(P<0.01)，如Tab 3所示。

Tab 3 Effects of AD on content of SOD and

2.5 AD调控TLR3信号通路关键蛋白的表达与Virus组相比，药物干预后，Virus+AD组中TLR3、TBK1、IRF3的表达升高(P<0.01)，但不同剂量AD对相关因子调控结果不同。

3 讨论

甲型流感病毒易突变，传染性强，属于高致病性流感病毒亚型[2]。中药黄芪具有抗病毒[3]、抗肿瘤[4]、抗炎性损伤以及保护心血管等多种生物学功能[5-6]。本实验结果显示黄芪水煎剂具有抗流感病毒活性，可改善流感病毒所致的细胞G1期阻滞，使细胞内SOD升高，MDA降低，并影响TLR3信号通路关键蛋白表达。此外，在研究过程中，我们发现黄芪注射液和黄芪水煎剂在TLR3信号通路相关的抗病毒机制上存在差异，推测可能由不同剂型成分差异所致，对此我们将作进一步研究。

(致谢：本实验在北京中医药大学生命科学学院生物科学系完成，在此表示感谢!)