基于网络药理学方法研究大黄牡丹汤治疗阑尾炎的作用机制及分子基础

朱远贵 朱志成 冯波 夏雨

（江西省中西医结合医院普外一科 南昌 330003）

阑尾是盲肠的一部分，它的根部连接于盲肠的后内侧壁，阑尾炎会表现为右下腹疼痛及压痛。急性腹痛最常见的病因就是急性阑尾炎，急性阑尾炎需手术治疗[1]。阑尾炎终生患病风险为6%～7%。阑尾炎好发于青少年人群，发病率在20～30 岁达到高峰[2]。阑尾炎常用治疗方式虽然为手术治疗，但是中药复方辅助治疗仍旧起到了不可忽略的作用[3]。大黄牡丹汤为泻下复方，具有泻热破瘀、散结消肿之功效，主治肠痈初起，湿热瘀滞证[4]，临床常用于治疗急性单纯性阑尾炎、急性胆道感染等湿热瘀结证[5]。网络药理学方法为现代研究的先进成果，它不仅符合中药复方整体、系统之理念，且深入于微观分子层面，可从现代化角度解释中药复方作用机制，为中医药现代化发展做出了不可忽略的贡献[6]。本研究运用网络药理学探讨大黄牡丹汤治疗阑尾炎的分子机制，以期为中药复方治疗阑尾炎研究提供有效参考。现报道如下：

1 工具与方法

1.1 大黄牡丹汤化学成分筛选及活性靶点构建在中药系统药理学数据库及分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）中，检索大黄牡丹汤中“大黄、牡丹皮、桃仁、冬瓜子、芒硝”每味中药化学成分，设置口服利用度（Oral Availability， OB）≥30%，类药性（Drug-likeness，DL）≥0.18 作为筛选条件[7]。

1.2 大黄牡丹汤作用靶点、 阑尾炎疾病靶点Venn分析及中药活性成分-靶点-疾病网络构建 通过TCMSP 数据库搜索大黄牡丹汤活性成分对应的作用靶点，并校正相应靶点，以关键词“appendicitis”检索Genecards 数据库（https://www.genecards.org/），搜集阑尾炎相关疾病靶点，采用Excel 2019 分析并绘制Venn 图，运用Cytoscape 3.6.0 构建大黄牡丹汤活性成分-潜在靶点-阑尾炎疾病网络图。

1.3 蛋白质-蛋白质互作关系（PPI）网络拓扑分析、核心靶点的筛选、 富集分析 运用String 平台对交集靶点进行分析，限定种属为“Home sapiens”人源，分析模式选择“Multiple proteins”，置信度设置为0.4，构建蛋白互作网络。将网络导入Cytoscape 运用CytoNCA 插件进行网络拓扑分析[8]。将核心靶点导入David 平台，对大黄牡丹汤治疗阑尾炎的核心靶点进行基因本体（GO）分子功能和基因组百科全书（KEGG） 信号通路富集分析，物种选为“Home sapiens”，以错误发现率（False Discovery Rate，FDR）＜0.05 作为显著功能和通路的临界值，获取相应的数据，绘制相应图形[9]。

2 结果

2.1 大黄牡丹汤有效成分 最终获得大黄牡丹汤有效活性成分11 种，其中大黄6 种、牡丹皮2 种、桃仁2 种、冬瓜子1 种。有效化合物信息见表1。

表1 大黄牡丹汤活性化合物成分信息

2.2 大黄牡丹汤作用靶点、 阑尾炎疾病靶点Venn分析及中药活性成分-靶点-疾病网络 通过TCMSP 检索化合物对应靶点得化合物靶点526 个，经过删除重复值、Uniprot 数据库校正后得到166 个有效靶点；搜索Genecards 数据库获得阑尾炎疾病靶点709 个。对两者靶点进行Venn 分析得交集靶点62 个。见图1。将62 个核心靶点对应的活性化合物及阑尾炎疾病靶点通过Cytoscape 构建大黄牡丹汤活性成分-潜在靶点-阑尾炎疾病网络图。见图2。

图1 大黄牡丹汤与阑尾炎交集靶点Venn 图

图2 大黄牡丹汤活性成分- 潜在靶点- 阑尾炎疾病网络图

2.3 蛋白质-蛋白质互作关系网络拓扑分析、 核心靶点筛选、富集分析 将62 个潜在靶点导入String平台进行PPI 网络拓扑分析。见图3。再将String 平台生成的tsv 格式文件导入Cytoscape 使用CytoNCA 插件进行网络拓扑分析，计算各个网络节点的DC、BC、CC，取DC、BC、CC 值前6 位节点进行网络拓扑分析，最终得到白细胞介素-6（Interleukin6，IL-6）、肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor， TNF）、蛋白激酶B1（AKT1）、肿瘤蛋白P53（TP53）、VEGFA、JUN 6 个核心靶点。见图4。其靶点拓扑分析信息见表2。将6 个核心靶点导入David平台进行GO、KEGG 富集分析，设置阈值为：生物过程（Biological Processes， BP）、细胞组分（Cellular Component， CC）、分子功能（Molecular Function，MF）count≥5，ease≥0.1，按照P值升序取排列前10条GO 富集信息[10]。见图5。KEGG 富集分析设置阈count≥5，ease≥0.1，按照P值升序取排列前20 条KEGG 富集信息。见图6。GO 富集分析显示靶点基因主要涉及RNA 聚合酶Ⅱ启动子的转录正调控、一氧化氮生物合成过程的正调控、平滑肌细胞增殖正调控、蛋白磷酸化正调控等；KEGG 富集结果显示大黄牡丹汤可能具有调控FoxO 信号通路、鞘脂类信号通路、Toll 样受体信号通路等功效。

表2 靶点及分子拓扑信息

图3 大黄牡丹汤潜在靶点的PPI 网络图

图4 大黄牡丹汤核心靶点PPI 网络关系图

图5 大黄牡丹汤核心靶点的GO 富集分析

图6 大黄牡丹汤核心靶点的KEGG 富集分析

3 讨论

大黄牡丹汤的网络药理学研究显示，大黄牡丹汤主要作用于AKT1，蛋白激酶AKT1 是细胞内生长因子信号传导的主要效应因子之一，引发炎症反应的关键基因[11]。大黄牡丹汤可能通过调控AKT1基因表达抑制炎症反应从而达到治疗阑尾炎的疗效。临床研究显示，阑尾炎患者IL-6、TNF、TP53 基因表达均高于正常组，这表明IL-6、TNF、TP53 基因的异常表达为引发阑尾炎的关键基因，调控这些基因的表达可能会对阑尾炎达到治疗作用[12]。富集分析结果表明，大黄牡丹汤主要参与FoxO 信号通路、鞘脂类信号通路、癌症通路、肿瘤坏死因子信号通路、Toll 样受体信号通路。此外，核心靶点相关疾病包含恰加斯病（美洲锥虫病）、前列腺癌、黑素瘤、胰腺癌、神经胶质瘤、癌症的中枢碳代谢、非小细胞肺癌、子宫内膜癌。这表明大黄牡丹汤可能有这些疾病的治疗优势。

大黄牡丹汤重要活性化合物为大黄酸、芦荟大黄素、山柰酚、槲皮素、谷甾醇、豆甾醇等。其中大黄酸、芦荟大黄素为中药大黄中可提取的蒽醌类化合物，药理活性多样，包括具有保护心血管、抗肿瘤、抗炎、抗癌、抗菌、免疫调节等广泛的药理活性[13]。槲皮素是一种天然的生物活性类黄酮，存在于多种蔬菜和水果中，在多种人类癌细胞中显示出良好的抗转移特性，经槲皮素作为对照条件下的细胞伤口愈合时间延迟，这表明经槲皮素处理的细胞中AKT1 基因表达明显下调[14]。研究发现山柰酚能显著抑制MAPK 通路的表达，干扰素诱导的IL-6 炎症因子的产生，从而有效抑制炎症的发生[15]。

大黄牡丹汤有效成分多样，作用网络复杂，本研究选取的核心有效成分为直接作用于阑尾炎症状治疗的成分，并未系统体现该复方泻热破结、散结消肿之中医理论，其他成分也可能通过间接作用发挥治疗阑尾炎效果，这有待后续研究进一步考证。