环状RNA CDR1as在乳腺癌中的表达及其临床意义

薛迪新，徐钰，陈积贤，陈澄亮，贺新伟，梁美珍，吴伟力

温州医科大学附属第三医院，浙江 温州 325200，1.甲乳外科；2. 血液内科

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，且发病率在我国呈逐年上升趋势。乳腺癌一旦发生腋窝淋巴结转移，预后将变差，如发生远处转移，治疗困难。目前乳腺癌转移的确切机制仍不清楚，深入研究乳腺癌转移的分子机制，寻找侵袭和转移过程中关键的分子，对治疗及改善乳腺癌患者的预后有极其重要的意义。

研究发现在肿瘤组织中存在一种异常表达的非编码circRNA CDR1as，参与肿瘤的侵袭和转移[1-2]。在许多实体瘤中发现circRNA CDR1as参与肿瘤的侵袭和转移，比如黑色素瘤、非小细胞肺癌[3-4]，而在乳腺癌组织中，研究也发现circRNA CDR1as表达升高[5]，目前相关文献鲜有报道circRNA CDR1as是否参与乳腺癌的侵袭和转移，本研究将探讨circRNA CDR1as在乳腺癌中的表达及临床意义。

1 资料和方法

1.1 一般资料 收集温州医科大学附属第三医院甲乳外科2018年6月至2019年9月手术切除的97例乳腺癌患者的癌组织及其距离癌组织2 cm的癌旁正常乳腺组织，所有患者术前均未进行放化疗及内分泌治疗，术中将标本迅速放入液氮中速冻，然后保存在-80 ℃冰箱中用于RNA的提取。乳腺癌的TNM分期根据2017年美国癌症联合委员会乳腺癌分期（第八版）。97例乳腺癌患者均为女性，其中乳腺导管原位癌10例，乳腺浸润性导管癌87例。本研究经温州医科大学附属第三医院伦理委员会同意并批准。

1.2 方法 采用TRIzol试剂（美国Invitrogen公司）进行RNA提取，取约60 mg的组织块直接放入研体中，加入少量液氮，迅速研磨，加入TRIzol试剂，并用1.5%琼脂糖电泳检测RNA的完整性。反转录采用PrimeScriptTMRT试剂盒（日本Takara公司），反应条件如下：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。RT-qPCR采用SYBR®Premix Ex TaqTMII（日本TaKaRa 公司），20 μL体系参照说明书，反应条件如下： 95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40个循环，所有实验重复3次，以β-actin为内参。RT-qPCR的引物序列具体如下：circRNA CDR1as正向引物5’-GAAA ATCCACATCTTCCAGACAA-3’，circRNA CDR1as反向引物5’-GAAGACATGGATATTGAGCCAGT-3’，β-actin正向引物5’-TAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3’，β-actin反向引物5’-TCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3’。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS17.0软件进行数据分析。正态分布计量资料以±s表示，两组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CircRNA CDR1as在乳腺癌组织中的表达 研究结果显示，在97例乳腺癌组织中，circRNA CDR1as的相对表达量为1.217±0.609；而癌旁的正常乳腺组织中circRNA CDR1as的相对表达量为0.703±0.532，两者差异有统计学意义（P＜0.05），提示在乳腺癌组织中，circRNA CDR1as的表达升高。

2.2 CircRNA CDR1as在乳腺浸润性导管癌中的表达 在97例乳腺癌组织中，导管原位癌为10例，浸润性导管癌为87例。在乳腺导管原位癌中，circRNA CDR1as的相对表达量为0.711±0.332，而在乳腺浸润性导管癌中circRNA CDR1as的相对表达量为1.278±0.608，两者差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 CircRNA CDR1as表达与浸润性癌临床病理特征的关系 结果显示，circRNA CDR1as在不同乳腺癌的大小、淋巴结转移情况及临床分期表达差异有统计学意义（均P＜0.05）。见表1。

表1 CircRNA CDR1as的表达与乳腺癌患者临床病理特征的关系

3 讨论

circRNA是一种非编码RNA，一般通过海绵吸附微小RNA来发挥生物学功能。大量研究表明，在许多实体肿瘤中circRNA出现异常表达，同时研究显示异常表达的circRNA调控肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭和转移。SONG等[6]研究显示，在宫颈癌中hsa_ circRNA_101996表达升高，升高的hsa_circRNA_ 101996通过下调miR-8075的表达激活TPX2基因的表达，从而促进宫颈癌细胞的增殖、侵袭和转移。XU等[7]研究显示，在卵巢癌中，circRNA-UBAP2表达升高，升高的circRNA-UBAP2通过调控miR-382-5p/PRPF8，来促进卵巢癌细胞的增殖和凋亡。DENG等[8]研究发现，在大肠癌中，circRNA_0001946表达升高，升高的circRNA_0001946通过调控microRNA-135a-5p的表达促进细胞发生上皮间质转化（epithelialmesenchymal transition, EMT），从而促进大肠癌细胞的侵袭和转移。而在乳腺癌中，同样发现许多异常表达的circRNA，参与癌细胞的增殖、凋亡、侵袭和转移[9-11]。

在肿瘤细胞中circRNA的异常表达，可通过使肿瘤细胞发生EMT，促进肿瘤发生侵袭和转移。REN等[12]研究显示，在肝癌组织及细胞中，hsa_circ_ 0011946表达升高，沉默hsa_circ_0011946表达可抑制癌细胞EMT的过程，使肝癌细胞的侵袭和转移受到抑制。在食管鳞状细胞癌中，hsa_circ_0012563表达升高，通过沉默hsa_circ_0012563表达可抑制癌细胞EMT的进程，使食管癌鳞状细胞的增殖、侵袭和转移受到抑制[13]。而在非小细胞肺癌[14]、胃癌[15]、恶性胶质瘤[16]中异常表达的circRNA也与肿瘤细胞的EMT有关。

近年来，研究发现circRNA CDR1as在许多实体瘤中表达异常，并参与肿瘤的发生发展。ZHANG 等[17]研究表明，在非小细胞肺癌细胞中，通过过表达circRNA CDR1as，可促进癌细胞增殖，而敲除circRNA CDR1as的表达，则会诱导癌细胞的凋亡。LI等[4]同样研究非小细胞肺癌发现在癌组织中 circRNA CDR1as表达升高，通过沉默circRNA CDR1as的表达，明显抑制癌细胞的侵袭和转移，促进癌细胞的凋亡，进一步研究显示，circRNA CDR1as可通过调控miR-219a-5p/SOX5轴发挥上述的致癌机制。TANG等[18]研究显示，circRNA CDR1as在大肠癌组织中表达升高，升高的circRNA CDR1as与大肠癌的肿瘤的大小、T分期、淋巴结转移及预后相关。YANG等[5]研究发现在乳腺癌组织中，circRNA CDR1as表达升高，通过沉默RNA CDR1as的表达，来上调miR-7的表达，从而下调REGγ基因的表达，使耐药的乳腺癌细胞对药物的敏感性增强。

本研究结果显示，与癌旁正常的乳腺组织相比，乳腺癌组织中circRNA CDR1as表达升高，与YANG等[5]的研究结果相似。在收集的97例乳腺癌组织中，导管原位癌为10例，浸润性导管癌为87例，与导管原位癌相比，在浸润性导管癌中circRNA CDR1as表达升高。

进一步分析87例浸润性导管癌中circRNA CDR1as的表达情况与临床病理特征的关系，研究结果显示，circRNA CDR1as在浸润性导管癌中的表达在不同乳腺癌的大小、淋巴结转移情况及临床分期有差异，提示circRNA CDR1as与乳腺癌的大小、淋巴结转移情况及临床分期有关，后续还需进一步研究。