原发性EB病毒感染患儿AIM2炎症小体通路的表达及与肝损伤的相关性

金龙腾，孙妍，黄基红，温正旺，石海矾，陈益平

温州医科大学附属第二医院育英儿童医院 儿童感染科，浙江 温州 325000

EB病毒（Epstein-Barr virus, EBV）是非嗜肝病毒感染引起肝损伤的常见病原体，原发性EBV感染患者中有70%～90%合并有肝损害[1]，而EBV感染导致肝损伤的机制较为复杂，其中免疫炎症反应起着重要作用[2]。固有免疫是机体抵御病原微生物入侵的第一道防线。黑素瘤缺乏因子2（absent in melanoma 2, AIM2）是细胞质双链DNA（double stranded DNA, dsDNA）感应蛋白，可识别外来病原菌或者自身细胞质内异常存在的DNA，并触发炎症体级联反应的激活，导致炎性细胞因子[白细胞介素（interleukin, IL）-1β、IL-18）]的成熟释放，发挥促炎作用[3]。AIM2炎症小体通路是否参与EB病毒感染导致肝损伤目前尚不明确。本研究拟分析原发性EBV感染患儿外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PMSCs）AIM2炎症小体通路的表达变化，探讨AIM2炎症小体与肝损伤的相关性。

1 对象和方法

1.1 对象 收集2020年1月至2021年6月在温州医科大学附属第二医院育英儿童医院住院治疗的原发性EBV感染患儿82例为原发感染组，男42例，女40例，年龄（5.2±2.0）岁。参照儿童EB病毒感染相关疾病的诊断和治疗原则专家共识（2021版）[4]，入院时EB-VCA-IgM和血清EBV-DNA检测均阳性，按有无肝损伤分为肝功能异常组（52例）与肝功能正常组（30例），排除标准：①EBV以外的细菌、病毒、支原体、衣原体感染者；②除EBV感染外患其他原发性或继发性致肝损伤患儿；③近期服用肝损伤药物者；④恶性肿瘤性疾病、自身免疫性疾病、血液系统疾病及近期使用免疫抑制剂的患儿；⑤严重心、肝、肾及其他脏器功能异常患儿。同期选取门诊体检EBV-IgG阳性（EB-VCA-IgG、EB-NA-IgG）而EB-VCA-IgM阴性的50例健康儿童为既往感染组，男25例，女25例，年龄（4.7±2.0）岁。门诊体检EBVIgG和EBV-VCA-IgM均阴性的50例健康儿童为对照组，男27例，女23例，年龄（4.6±1.9）岁。3组研究对象性别、年龄比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。原发性EBV感染肝功能异常的患儿在住院1周后复查肝功能，38例肝功能恢复正常，14例肝功能好转。本研究通过医院伦理委员会批准（编号：2021-K-125-01），所有研究对象监护人知情同意。

1.2 标本采集、处理 原发性EBV感染患儿于入院次日、既往EBV感染组及对照组于体检当日抽取空腹静脉血，EDTA抗凝管2 mL用以分离PBMCs。抗凝管取血清，加入等体积PBS混匀，再加入等体积人淋巴细胞分离液（北京索莱宝科技有限公司），1 500 r/min 离心20 min后出现分层，留取单个核细胞层，加入5倍体积PBS洗涤后离心留取沉淀，保存于-80 ℃冰箱。促凝剂管3 mL，3 500 r/min离心20 min分离血清，-80 ℃冻存。

1.3 AIM2、ASC和caspase-1的mRNA检测 按TRIzol总RNA提取试剂盒（北京普利莱基因技术有限公司）说明提取PBMCs总RNA，使用紫外分光光度计测量总RNA纯度和浓度。采用实时荧光定量PCR检测AIM2、ASC和caspase-1的mRNA表达，引物序列见表1。引物均由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反应条件：95 ℃，5 min，95 ℃，10 s，60 ℃，30 s，共40个循环，每个样品设3个平行复孔。使用2-ΔΔCt计算AIM2、ASC和caspase-1的mRNA相对表达量。

表1 PCR引物序列（5’-3’）

1.4 IL-1β、IL-18蛋白及其他生化指标的检测 采用ELISA法检测血清中IL-1β、IL-18蛋白水平，试剂盒均购自上海研域化学试剂公司。其他常规检测，包括谷丙转氨酶（alanine aminotransferase,ALT）、谷草转氨酶（aspartate transaminase,AST）、EBV抗体、血清EBV-DNA检测（检测下限是5.0×102拷贝/mL），由我院检验科完成。

1.5 统计学处理方法 应用SPSS22.0统计软件进行数据处理。正态分布计量资料采用±s表示，两组均数比较采用独立样本t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析；非正态分布计量资料以M（P25，P75）表示，多组间比较采用Kruskal-WallisH检验，组间两两比较采用Nemenyi检验；相关性分析采用Pearson相关。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组AIM2、ASC和caspase-1的mRNA表达及IL-1β、IL-18水平 原发感染组患儿外周血AIM2、ASC和caspase-1 mRNA的表达量及IL-1β、IL-18水平均高于既往感染组和对照组（P＜0.05），既往感染组与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1。

图1 原发感染组与既往感染组AIM2炎症小体mRNA相对表达量和IL-1β、IL-18水平

2.2 肝功能异常组与肝功能正常组患儿AIM2、ASC和caspase-1表达及IL-1β、IL-18水平 原发感染组中，肝功能异常组、肝功能正常组患儿AIM2、ASC和caspase-1的mRNA表达量及IL-1β、IL-18水平均高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；肝功能异常组相较肝功能正常组更高（P＜0.05），见图2。

图2 肝功能异常组与肝功能正常组AIM2炎症小体mRNA相对表达量和IL-1β、IL-18水平

2.3 原发感染组患儿AIM2 mRNA表达与ASC、 caspase-1 mRNA表达及IL-1β、IL-18水平的相关性 Pearson相关分析显示，原发性EBV感染患儿AIM2 mRNA表达与ASC、caspase-1 mRNA表达以及IL-1β、IL-18水平均呈正相关（r=0.718、0.729、0.548、0.529，P＜0.05），见图3。

图3 原发感染组患儿AIM2 mRNA表达与ASC、caspase-1 mRNA表达及IL-1β、IL-18的相关性

2.4 原发感染组患儿血清EBV-DNA载量与AIM2、ASC、caspase-1 mRNA表达和IL-1β、IL-18水平相关性 Pearson相关性分析显示，原发感染组EBV-DNA载量与AIM2、ASC、caspase-1 mRNA表达及IL-1β、IL-18水平均呈正相关（r=0.712、0.494、0.479、0.384、0.300，P＜0.05），见图4。

3 讨论

EBV是一种嗜淋巴细胞的DNA病毒，可出现全身多个系统受累，其中肝损伤是原发性EBV感染最常见的并发症，但EBV导致肝损伤的发病机制目前尚不明确。目前的研究发现EBV只在肝脏的淋巴细胞核中检测到，EBV没有直接侵犯肝细胞、胆道上皮细胞和血管内皮细胞，其对肝脏的损伤可能是EBV感染后淋巴细胞浸润和炎症因子导致的免疫损 伤[2，5]。

炎症小体是一种存在细胞胞浆中的蛋白聚合物，主要由模式识别受体（pattern recognition receptor, PRRs）、凋亡相关斑点样蛋白（apoptosisassociated speck-like protein, ASC）以及 caspase-1前体组成。炎症小体的激活可诱导多种细胞因子的产生，在固有免疫中发挥重要作用[3]。2002年首次提出AIM2炎症小体，主要由AIM2、ASC以及pro-caspase-1组成，AIM2通过识别入侵机体的病原体的dsDNA组装成炎症小体，激活caspase-1介导细胞焦亡以及IL-1β、IL-18的成熟和释放，参与机体抗感染免疫反应[6-7]。通过体外细胞感染模型发现土拉弗朗西斯菌、单核李斯特菌、肺炎链球菌、乙型肝炎病毒、鼠巨细胞病毒等病原体感染可激活AIM2炎症小体[7]。最近有研究发现EBV感染可诱导人单核细胞中AIM2炎症小体的激活及caspase-1依赖性IL-1β分泌[8]，但AIM2炎症小体与EBV感染导致的肝损伤是否存在相关性，目前尚未见报道。本研究显示，原发性EBV感染患儿外周血AIM2、ASC和caspase-1 mRNA表达量均显著高于既往感染组及对照组，并且AIM2、ASC和caspase-1 mRNA表达水平及IL-1β、IL-18水平与EBV DNA载量有正相关性，提示AIM2炎症小体通路可能参与了原发EBV感染过程。

炎性小体激活炎性细胞因子的产生和细胞焦亡对肝脏具有重要的生物学效应。目前发现炎症小体参与非酒精性脂肪性肝病、乙型病毒性肝炎、肝纤维化和肝癌等肝脏疾病的发病机制[9]。HAN等[10]比较慢性乙型病毒性肝炎（chronic viral hepatitis B, CHB）与慢性丙型病毒性肝炎（chronic viral hepatitis C, CHC）患者活检肝脏组织，发现CHB患者AIM2的表达显著高于CHC，并且在HBV高载量组（HBV-DNA≥1×105拷贝/mL）中AIM2的表达高于HBV低载量组（HBV-DNA＜1×105拷贝/mL）。AIM2水平与CHB患者中caspase-1、IL-1β和IL-18的表达呈正相关，提示AIM2表达与CHB相关的炎症反应相关。既往研究发现EBV感染引起肝损伤患儿体内免疫功能紊乱比肝功能正常组患儿更为明显[11]。本研究显示，原发性EBV感染患儿中，肝功能异常组AIM2、ASC和caspase-1 mRNA表达量及IL-1β、IL-18水平高于肝功能正常组，且AIM2 mRNA表达与ASC、caspase-1的mRNA表达以及IL-1β、IL-18水平均呈正相关，这表明EBV-DNA与AIM2炎症小体结合后可能导致caspase-1的活化，并进一步促进IL-1β、IL-18的分泌，从而在EBV肝炎中发挥作用。

综上所述，原发EBV感染患儿AIM2炎症小体通路的表达发生改变，并且与EBV感染所致肝损伤存在相关性，这为EBV感染致肝损伤的治疗提供了新的研究参考。