麻黄连轺赤小豆汤对特应性皮炎模型小鼠皮肤屏障功能的影响*

袁慧敏，孙燕，李彩艳，刘双巧，张玉鑫，刘锦钢，汤阳，张淑静，冯婧，郑丰杰

北京中医药大学，北京 100029

特应性皮炎（atopic dermatitis，AD）是一种慢性复发性、瘙痒性、炎症性皮肤疾病，以炎性渗出、湿疹样皮损、苔藓化和皮肤干燥为主要临床表现，其患病率呈逐步上升趋势，特别是儿童患病率超过20%，严重影响患者生活质量［1］。AD病因及发病机制尚未阐明，目前认为其与遗传、环境、皮肤屏障损伤和神经免疫失调等因素密切相关［2］，而皮肤屏障和免疫炎症失衡之间的内外窜扰是AD发生发展的重要病理机制，已成为业内共识，皮肤屏障损伤及修复已成为AD防治领域的重要研究课题之一［3］。

AD属于中医学“乳癣”“奶癣”“四弯风”等病证范畴，其病因病机主要是先天禀赋不足、胎毒遗热或后天调摄不当、脾失健运，复感风、湿、热邪，蕴郁肌肤，具有表里同病、虚实夹杂的病证特点［4］。麻黄连轺赤小豆汤出自《伤寒论》，外可发散风湿热邪，内能健脾和中、清热利湿，是公认的表里双解、标本同治之剂，临床用其加减辨治AD疗效颇佳［5-6］，但其对AD皮肤屏障功能的影响尚需要进一步的研究。

1 材料

1.1 动物SPF级6周龄雄性BALB／c小鼠120只，体质量（20±2）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SYXK（京）2016-0006。饲养于北京中医药大学动物房IVC通气笼，环境温度（25±2）℃，湿度40%～60%，每天自由饮水进食。本研究实验动物的使用和处置方法符合动物福利的要求，实验经北京中医药大学实验动物伦理委员会审查批准（动物伦理编号：BUCM-4-2019091101-3047）。

1.2 药物与试剂麻黄、连翘、苦杏仁、赤小豆、大枣、桑白皮、炙甘草、生姜（北京同仁堂药店）；糠酸莫米松凝胶［规格：0.1%，华润三九（南昌）药业有限公司，批号：2006007J］；2，4-二硝基氟苯（2，4-diitrofluorobenzene，DNFB，美国Sigma公司，批号：M24318031）；丙酮、无水乙醇（分析纯，北京化工厂，批号：20170209、20200617）；橄榄油（西班牙Mueloliva公司，批号：20190515）；二甲苯（分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司，批号：20190325）；苏木素染色液、伊红染色液（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：20042002、20060901）；分化液、返蓝染色液（北京益利精细化学品有限公司，批号：20200730、20200528）。

1.3 仪器H6型独立通风笼（苏杭科技器材有限公司）；MPA4型皮肤多探头测试仪（德国Courage+Khazakz公司）；HistoCore PEARL型全自动封闭式组织脱水机、HistoCore Arcadia H型石蜡包埋机、HistoCore Arcadia C型组织切片冷台、M2255型全自动切片机、HI1210型摊片机、HI1220型烤片机（德国Leica公司）；Revolve FL型正倒置一体荧光显微镜（美国Echo公司）。

2 方法

2.1 药物制备《伤寒论》记载麻黄连轺赤小豆汤由麻黄（二两）、连轺（二两）、杏仁（四十个）、赤小豆（一升）、大枣（十二枚）、生梓白皮（一升）、生姜（二两）、炙甘草（二两）组成，本课题组前期经考证实测，得出其现今临床参考剂量［7］：麻黄6 g，连翘6 g，苦杏仁3 g，赤小豆34 g，大枣7 g，桑白皮11 g，生姜6 g，炙甘草6 g。按上述剂量称取各药材，共79 g，为1次灌胃所需的生药量，加10倍量的水（即790 g），将药材完全没于水中浸泡1 h后，煎煮1.5 h，将药液倒出。再加入8倍量的水，煎煮1.5 h。将两次药液混合后，水浴浓缩，浓缩至1 g生药·mL-1，4℃冰箱储存备用。每次取当日灌胃剂量，于灌胃前30 min预热至适宜温度。

2.2 分组、造模与给药采用随机数字表法将120只雄性BALB／c小鼠分为正常组（n＝24）、模型组（n＝32）、糠酸莫米松组（n＝32）和麻黄连轺赤小豆汤组（n＝32）。除正常组外，其余组小鼠采用DNFB反复刺激皮肤的方法制备AD小鼠模型［8］。具体方法如下（见图1）：致敏前用电推剪和脱毛膏除去小鼠背部毛发，面积约2.0 cm×3.0 cm。在1.0 cm×1.0 cm的纱布上滴加1%的DNFB溶液200μL，并均匀涂抹在小鼠背部皮肤，每周2次（即第1、4、8、11天）。第15天开始改用0.2%的DNFB溶液涂抹小鼠背部皮肤，每周2次，持续3周（即第15、18、21、25、28、32、35天）。正常组小鼠于相应时间点在背部涂抹等量基质溶液（丙酮∶橄榄油＝4∶1）。分别在实验第4、18、32、39天进行药物干预，麻黄连轺赤小豆汤组用麻黄连轺赤小豆汤灌胃（11.98 g·kg-1·d-1），每日2次；糠酸莫米松组于小鼠皮损处均匀涂抹适量0.1%糠酸莫米松凝胶，每日2次；正常组和模型组给予等量常温蒸馏水灌胃，每日2次，连续7天。

图1 AD模型小鼠制备流程

2.3 动物处死与取材各时间点分别给药一周后，对实验动物进行取材，即分别于实验第11、25、39、46天，分四批次（每批次动物n＝30）对各组小鼠进行2%戊巴比妥钠溶液麻醉后，摘眼球取血处死，无菌条件下取小鼠皮损处皮肤组织，以4%多聚甲醛溶液固定保存；其他皮肤皮损组织-80℃保存，用于指标检测。

2.4 皮损评分参照文献［9］进行皮损评分评估。每次皮肤致敏前肉眼观察皮肤变化并拍照记录，从出血／红斑、疤痕／干燥、水肿、表皮脱落／侵蚀／苔藓样变四方面进行等级评分。

2.5 经皮水分散失（trans epidermal water loss，TEW L）检测于每次皮肤致敏前和处死前，平展小鼠背部剃毛区域，使用Tewameter TM300探头轻触小鼠皮肤，应用皮肤测定仪测定皮损及非皮损处经皮散水量，使用标准测量法，设置每次测定时间为20 s，重复检测3次，读取平均值。保持每次检测时间、室内环境、检测人员及其他条件相对一致。

2.6 皮肤pH值检测于每次皮肤致敏前和处死前，使用pH 905探头测定皮损及非皮损处pH值，每次重复检测3次，结果取平均值。保持每次检测时间、室内环境、检测人员及其他条件相对一致。

2.7 皮肤组织病理学取小鼠剃毛区域皮肤组织，以4%多聚甲醛溶液固定过夜，将组织标本脱水、石蜡包埋、切片（厚度6μm）、脱蜡、苏木精-伊红（htoxylin eosin，HE）染色，显微镜下观察组织病理改变。

2.8 皮损评分、TEW L、pH的相关性分析考察选择模型组四个时间点皮损评分、pH值与TEWL值的相关数据进行斯皮尔曼（Spearman）相关性分析，评估三者对AD模型的影响。

2.9 统计学方法采用GraphPad Prism 9统计学软件进行数据处理分析，各组数据以平均值±标准差（±s）表示。多组计量资料采用单因素方差分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 麻黄连轺赤小豆汤对AD模型小鼠皮肤状态的影响AD模型组小鼠复制过程中不同时间点，其皮损呈现出与临床相近的不同病理进程［2，10-11］，即急性期（第1—11天）依次为红斑、出血点→皮肤水肿溃烂→新生血痂→血痂变硬；急性进展期（第12—25天）表现为血痂脱落与新生瘢痕并存；亚急性期（第26—39天）皮肤散在红斑出血点、瘢痕增生、鳞屑或苔藓样干燥等；慢性期（第39天以后）主要以皮肤干燥为主。糠酸莫米松和麻黄连轺赤小豆汤均可有效改善AD小鼠皮损，且麻黄连轺赤小豆汤作用效果优于糠酸莫米松，可显著减少AD模型小鼠皮肤亚急性期出血点，改善皮肤干燥鳞屑或苔藓样现象。见图2。

图2 不同时间点各组小鼠背部皮损观察

3.2 麻黄连轺赤小豆汤对AD模型小鼠皮损评分的影响与正常组相比，模型组小鼠各时间点皮损评分均显著升高（P＜0.01）。与模型组相比，糠酸莫米松组小鼠皮损评分在急性期、急性进展期有下降趋势；麻黄连轺赤小豆汤组在各时期均有下降趋势，但无统计学差异。见表1。

表1 不同时间点各组小鼠背部皮损评分比较 （±s，n＝6）

表1 不同时间点各组小鼠背部皮损评分比较 （±s，n＝6）

注：与正常组比较，**P＜0.01

组别 皮损评分（分）第11天 第25天 第39天 第46天0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00模型组 4.67±0.52** 1.67±0.52** 1.50±0.55** 1.33±0.52**糠酸莫米松组 4.33±0.52 1.50±0.55 1.67±0.52 1.33±0.52麻黄连轺赤小豆汤组正常组3.83±0.41 1.33±0.52 1.33±0.52 1.17±0.41

3.3 麻黄连轺赤小豆汤对AD模型小鼠皮肤组织病理学改变的影响正常组小鼠皮肤组织结构规则，细胞形态正常，上皮层次完整清楚。AD模型组小鼠4个观察点皮肤组织表现依次为：表皮增厚，以棘细胞层增厚为主→表皮增厚，棘细胞层增生变厚→表皮增厚，棘细胞层显著增厚→表皮增厚减轻，棘细胞层增生减轻等。与模型组相比，糠酸莫米松和麻黄连轺赤小豆汤可不同程度的改善模型小鼠皮肤病理改变，如减少上皮增生等。见图3。

图3 不同时间点各组小鼠皮肤组织病理学观察（HE染色，×10）

3.4 麻黄连轺赤小豆汤对AD模型小鼠皮肤TEWL的影响与正常组相比，模型组小鼠皮损区各时间点TEWL值均显著升高（P＜0.01）。与模型组相比，麻黄连轺赤小豆汤组与糠酸莫米松组小鼠第11天皮肤TEWL明显升高（P＜0.01），第25、39、46天3个时间点皮肤TEWL均降低，且麻黄连轺赤小豆汤组小鼠第39、46天两个时间点TEWL值显著下降（P＜0.01）。见表2。

表2 不同时间点各组小鼠背部皮损区皮肤TEWL比较 （±s，n＝6）

表2 不同时间点各组小鼠背部皮损区皮肤TEWL比较 （±s，n＝6）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，＃＃P＜0.01

组别 皮肤TEWL（g·h-1·m-2）第11天 第25天 第39天 第46天12.93±2.61 12.60±2.11 16.85±3.07 8.70±2.37模型组 72.73±6.24** 54.97±4.65** 50.80±9.02** 14.40±1.43**糠酸莫米松组 88.20±3.01＃＃ 45.18±9.12 45.52±4.81 11.92±1.13麻黄连轺赤小豆汤组 89.03±6.55＃＃ 41.63±12.80 33.50±2.44＃＃ 9.70±1.22正常组＃＃

3.5 麻黄连轺赤小豆汤对AD模型小鼠皮肤pH的影响与正常组相比，模型组小鼠皮损区第11、25、39天3个观测点pH值均明显升高（P＜0.01），第46天有升高趋势。与模型组相比，糠酸莫米松组小鼠第11天皮肤pH值显著降低（P＜0.01）；麻黄连轺赤小豆汤组小鼠第11、25、39天3个观测点皮肤pH值均明显降低（P＜0.05），第46天有降低趋势，但无统计学差异。见表3。

表3 不同时间点各组小鼠背部皮肤pH比较 （±s，n＝6）

表3 不同时间点各组小鼠背部皮肤pH比较 （±s，n＝6）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

组别 皮肤pH第11天 第25天 第39天 第46天5.59±0.20 6.31±0.35 6.74±0.28 6.42±0.40模型组 6.33±0.21** 7.07±0.19** 7.20±0.22** 6.54±0.13糠酸莫米松组 5.64±0.08＃＃ 6.81±0.49 7.08±0.17 6.51±0.18麻黄连轺赤小豆汤组 5.86±0.31＃ 6.43±0.21＃＃ 6.84±0.09＃正常组6.41±0.26

3.6 皮损评分、TEWL、pH的相关分析AD模型小鼠皮损评分与pH值呈线性正相关关系（Spearman R2＝0.211 7，P＝0.014 7）；皮损评分与TEWL值呈线性正相关关系（Spearman R2＝0.610 4，P＜0.000 1）；pH值与TEWL值呈线性正相关关系（Spearman R2＝0.351 2，P＝0.002 3）；提示经皮水分丢失增加，皮肤表面pH升高，可共同加重皮肤屏障功能障碍。见图4。

图4 皮损评分、TWEL、pH的相关分析

4 讨论

AD与遗传、过敏等因素有关，但其确切病因及发病机制尚未完全阐明，目前占主导地位的是学者Peter M.Elias提出的“内外串扰病机学说”［12-13］。“内外串扰病机学说”中，“内”主要指机体免疫功能失常及其引发的全身性过敏性炎症，“外”主要指遗传或后天环境因素造成的皮肤屏障功能受损，而关于皮肤屏障功能在AD发病中作用的揭示是过去10年里AD研究领域最重要的发现。皮肤屏障检测可客观反映皮肤功能，常用于皮肤病患者的诊疗［14］。HE组织学、皮肤B超、皮肤共聚焦显微镜等常用于皮肤细胞、结构层面观察；皮脂、天然保湿因子、神经酰胺等为皮肤成分测量指标；TEWL、皮肤pH、皮损评分等是进行皮肤屏障功能评估的常用无创性指标［15-16］。

完整的皮肤屏障是皮肤作为物理和免疫屏障的先决条件［17］。皮肤屏障功能的破坏作为AD发病的一个重要原因，不但引起水分丢失导致皮肤干燥、瘙痒，还使皮损部位对外界化学物质或病原体侵害刺激更敏感，促使炎症反应的发生，造成慢性、持续性皮肤炎症［18-19］，继而加重皮肤屏障功能损伤，形成恶性循环。以改善皮肤屏障功能为出发点的研究可能是打破AD恶性循环的重要突破口［20］。随着AD研究的深入，中医药对皮肤屏障功能的修复作用也越来越受到重视［21］。

中医学认为，AD多因先天禀赋不足、胎毒遗热或后天调摄不当，脾失健运，生湿化热，复感风湿热邪，蕴结肌肤，内外合邪而发病［22］，具有从急性期向慢性期转化并逐渐呈慢性的特征。从中医证候类型来看，以风湿热蕴证、湿热内蕴证（或湿热蕴结证）、脾虚湿盛证、血虚风燥证最为常见，发病初期或急性发作期以风湿热蕴、湿热内蕴（或湿热蕴结）、脾虚湿盛为主，久则血虚风燥，肌肤失养［23-24］。而AD皮损评分和TEWL从高到低依次为湿热蕴结＞脾虚湿蕴＞血虚风燥，且湿热蕴结证型以皮损红斑、丘疹、渗液为主要表现，其皮肤屏障功能损害最为严重［25］。

麻黄连轺赤小豆汤出自《伤寒论》，主治湿热发黄兼表邪未解者，由麻黄、连轺、赤小豆、生梓白皮、杏仁、生姜、炙甘草、大枣组成。方中连轺，现今临床多由连翘代替，因而也被称为麻黄连翘赤小豆汤。生梓白皮，后世医家多以桑白皮、茵陈等替代，实践证明行之有效［26］。现今临床广泛应用本方治疗特应性皮炎、湿疹及过敏性疾病，证属湿热熏蒸于表者［6，27］。如周芳等［28］报道用麻黄连轺赤小豆汤加减治疗青少年及成人特应性皮炎，可明显改善AD皮损及瘙痒，疗效优于开瑞坦；国医大师禤国维在治疗特应性皮炎时，也强调及早修复皮肤免疫防御功能的重要性［29］；本课题组常用本方治疗特应性皮炎、湿疹等皮肤病，屡获良效。但目前有关麻黄连轺赤小豆汤治疗AD的效应机制，仅有抗变态反应等相关研究，如陈建等［30］发现本方可抵抗组胺引起的瘙痒、抑制IgE产生和肥大细胞脱颗粒，研究尚待深入。

本课题组为观察麻黄连轺赤小豆汤防治AD的疗效及其效应机制，确定其治疗最佳时机，根据半抗原DNFB反复刺激皮肤建立AD小鼠模型的复制过程，结合不同时期AD的皮损特点，在造模开始第11、25、39、46天四个时间点进行动态观测。结果表明：实验初期模型小鼠急性发作，皮肤水肿溃烂结痂，急性进展期脱痂与瘢痕增生共现，亚急性期与慢性期表现为红斑出血点、鳞屑或苔藓样变以及皮肤干燥；中药麻黄连轺赤小豆汤和糠酸莫米松都能不同程度的改善皮损状况，相比于糠酸莫米松，麻黄连轺赤小豆汤在亚急性期及慢性期的治疗效果更为显著且持久，可明显缓解亚急性期及慢性期红斑、出血点表现与皮肤干燥、鳞屑或苔藓样变，减少经皮水分散失，降低pH值，改善皮损病理损伤。

值得注意的是，与其他时期各干预组小鼠TEWL下降相比，糠酸莫米松组和麻黄连轺赤小豆汤组小鼠急性期（第1～11天）TEWL明显升高；其次，AD慢性进展阶段（第39天以后），各组小鼠皮肤pH差异不明显。AD不同进展阶段其主要病理表现不同，实验初期，AD模型以皮肤水肿、溃烂为主，进而结痂，麻黄连轺赤小豆汤作为表里双解之剂，在内健脾和中清热利湿，在外发散风湿热邪，麻黄、杏仁调肺发表之功，可促进皮肤津液宣发输布，加速AD皮损水肿、溃烂进程，故而TEWL明显升高；而糠酸莫米松凝胶质地滋润，在治疗AD皮损的同时，亦可在水肿、溃烂皮损表面形成更加湿润的保护膜，故而糠酸莫米松组小鼠皮损TEWL亦升高。实验中后期，AD模型小鼠主要以皮肤干燥鳞屑样改变为主要皮损表现，出血、结痂、瘢痕增生等症状不明显，故而pH变化不显著。

综上所述，麻黄连轺赤小豆汤可有效改善AD模型小鼠皮肤屏障，以亚急性期效果最佳。在此基础上，我们后续将进一步从皮肤屏障组成如丝聚蛋白（filaggrin，FLG）、兜甲蛋白（loricrin，LOR）、内披蛋白（involucrin，IVL）和神经酰胺1（Ceramide 1，Cer 1）、Cer 3等角度，探讨麻黄连轺赤小豆汤改善皮肤屏障功能的相关效应机制，并将进行拆方研究，从AD“内外窜扰”发病环节探讨“表里双解”之麻黄连轺赤小豆汤防治AD的效应机制。