基于网络药理学和分子对接探讨枳实治疗乳腺癌的作用机制*

吴发胜，周尧红，何锦轶，李洲强，陈晓宇，陈慧，练祖平，侯恩存

1.广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530011；2.广西中医药大学，广西 南宁 530001

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，其发病率逐年上升，2018年全球新诊断乳腺癌患者约210万例，占所有新诊断癌症病例的24.2%，占所有与癌症相关女性病死率的15%［1］，在女性恶性肿瘤中的病死率仅次于肺癌。近年来，临床对乳腺癌的治疗也越来越重视。中药具有疗效显著、不良反应小的特点，故在癌症领域受到广泛关注。

枳实是芸香科酸橙及其栽培品种或甜橙的干燥幼果，具有破气消积、化痰消痞的功效，且有“非枳实不能消痞”一说。临床上枳实被用于治疗诸多疾病［2-6］。枳实含有多种有效成分和作用的靶点，但由于其潜在的活性成分及在乳腺癌治疗中的作用机制尚不清楚，故本研究采用网络药理学和分子对接，进一步探讨枳实治疗乳腺癌的机制，并为其应用于肿瘤疾病提供一定思路。

1 材料与方法

1.1 枳实活性化合物收集与筛选采用中药系统药理数据库和分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology，TCMSP）（http：／／lsp.nwu.edu.cn／tcmsp.php）进行研究，以药物生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、类药性（drug-likeness，DL）≥0.18为条件筛选枳实的活性化合物。

1.2 枳实化合物靶点收集将1.1中筛选出的活性化合物通过导入Drug Bank数据库（https：／／www.drugbank.ca／），进一步得到枳实化合物对应的作用靶点。

1.3 枳实化合物-靶点网络构建筛选出不重复的靶点，使用String数据库，输入靶点名称，并将物种限制为人类，最终得到所需靶点，利用Cytoscape3.7.2软件，构建枳实的化合物-靶点网络。

1.4 乳腺癌相关靶点的获取以“breast cancer”为检索词，使用Gene Cards（https：／／www.genecards.org／）、CTD（http：／／ctd.mdibl.org／）数据库检索得到乳腺癌的所有靶点，构建疾病数据库，筛选并剔除重复后得到目标靶点基因。

1.5 药物-疾病共同靶点的筛选及构建蛋白互作网络图利用Venn在线分析工具获得枳实和乳腺癌共同交集的靶点，并用Cytoscape3.7.2软件制作靶点相互作用网络图。

1.6 基因本体（gene ontology，GO）功能富集分析

利用DAVID6.8数据库对枳实作用于乳腺癌的靶蛋白进行GO功能富集分析，包括生物功能（biological function，BP）、细胞组分（cell composition，CC）、分子功能（molecular function，MF）。可视化分析枳实作用于乳腺癌的靶点GO功能富集结果。

1.7 京都基因和基因组百科全书（kyoto encyclopaedia of gene and genomes，KEGG）通路富集分析

进入DAVID平台，利用其中的KEGG通路富集分析功能，对枳实作用于乳腺癌靶点相关的43个蛋白质功能进行深入研究，结果得到共103条信号通路，将此导入omicshare（http：／／www.omicshare.com／）处理平台进行可视化分析。

1.8 分子对接通过TCMSP获得活性成分mol2格式，采用RCSB PDB（http：／／www.rcsb.org／）数据库检索相关蛋白晶体结构，保存为pdb格式，应用AutoDock软件进行分子对接。根据得到的binding energy的值评价活性成分和关键靶点之间的对接结果。

2 结果

2.1 枳实活性化合物的筛选利用TCMSP软件检索枳实中的活性化合物共65个，在药物标准OB≥30%和DL≥0.18的条件下筛选出22个化合物，包括：枸橘苷（poncirin）、异橙黄酮（Isosinensetin）、5，7，4'-三甲氧基黄酮（5，7，4'-Trimethylapigenin）、异樱花素-7-芸香糖苷（isosakuranetin-7-rutinoside）、独活素（Prangenin）、白芷属脑（prangenin hydrate）等。各化合物的OB和DL值见表1。

2.2 枳实化合物-靶点网络将枳实化合物对应的靶点导入STRING数据库，去除非人源蛋白和重复蛋白，得到两者之间更直观的相互作用，最后通过整合获得116个靶点。其中表1中poncirin（MOL013276）、prangenin hydrate（MOL013433）和Obacunone（MOL013352）这3个成分没有相对应的靶点。再次利用Cytoscape软件，构建枳实化合物-靶点网络图，在网络图中有135个节点274条相互关系，见图1。

图1 枳实化合物-靶点网络

表1 枳实22个活性成分信息

2.3 枳实治疗乳腺癌的作用靶点在Gene Cards（https：／／www.GeneCards.org／）、CTD（http：／／ctd.mdibl.org／）数据库中收集乳腺癌靶点，剔除重复数据后得到449个。利用Venn分析工具，绘制枳实化学成分与乳腺癌发病相关的靶点韦恩图，见图2，共有43个靶点基因，分别为MMP2、NOS2、MET、IL-10、MAPK1、BIRC5、MDM2、EGFR、IL-2、CREB1、ERBB2、IFNG、CHEK1、BCL2、TOP2A、MAPK8、BCL2L1、MAPK3、PPARG、RELA、GSTP1、RB1、CDK2、CYP19A1、TP53、INSR、CASP9、CDKN1A、CAT、AKT1、XIAP、PTGS2、CCND1、ESR1、CDK4、VEGFA、JUN、ESR2、BAX、MMP1、IL6、CASP3、MMP9。

图2 枳实-乳腺癌靶点韦恩图

2.4 枳实治疗乳腺癌的作用靶点蛋白互作网络将韦恩图中交集的43个潜在靶点导入Cytoscape软件，构建蛋白互作网络，见图3。图中共有43个节点，579条边，其中Degree值较大者是TP53、AKT1、CASP3、JUN、VEGFA、CCND1、MAPK1，表明这些蛋白是枳实治疗乳腺癌的关键靶点蛋白。

图3 枳实治疗乳腺癌作用靶点的蛋白互作网络

2.5 枳实治疗乳腺癌靶点GO功能富集分析GO功能富集分析，得出317条BP，主要包括转录的正调控、DNA模板化、RNA聚合酶Ⅱ启动子的正调控、细胞增殖和一氧化氮生物合成过程的正向调控、凋亡过程的负调控、药物反应、毒性反应等；有34条CC，包括细胞核、细胞质、细胞质膜微囊、胞液、线粒体、周期蛋白依赖的蛋白激酶全酶复合物等；有62条MF，包括蛋白质异构化活性、酶结合、转录因子结合、激酶活性、蛋白质同源二聚活性、BH3域绑定等。根据P值由小到大选取排名前10位的条目，通过GraphPad 8.4.0软件做出了BP、CC、MF的条形图，见图4。

图4 枳实治疗乳腺癌靶点的GO功能富集分析

2.6 KEGG通路富集分析和气泡图富集结果分析，枳实治疗乳腺癌共有103条通路，其中有癌症通路（Pathways in cancer）、PI3K-Akt信号通路（PI3KAkt signaling pathway）、HIF-1信号通路（HIF-1 signaling pathway）、FoxO信号通路（FoxO signaling pathway）、p53信号通路（p53 signaling pathway）、肿瘤坏死因子信号通路（TNF signaling pathway）等。排除“Hepatitis B”“Bladder cancer”“Pancreatic cancer”等与乳腺癌不相关的通路，根据P值，从小到大选择前20个的通路，将其导入omicshare平台，制作高级气泡图，见图5。

图5 枳实治疗乳腺癌作用靶点KEGG通路富集分析气泡图

2.7 KEGG通路富集分析图利用KEGG分析，将2.6中得到的103条通路按P值大小选取前20条信号通路。点击PI3K-Akt信号通路Chart，见图6。

图6 枳实中PI3K-Akt信号通路潜在靶基因的KEGG通路富集分析

2.8 分子对接验证选取“枳实化合物-靶点网络”图中排名前3位的化合物luteolin、naringenin、nobiletin与PPI网络图中Degree值排名靠前的8个关键节点TP53、AKT1、CASP3、JUN、VEGFA、CCND1、MAPK1、MAPK3，利用AutoDock软件进行分子对接。其中naringenin与AKT1、CASP3、MAPK1对接以及nobiletin与TP53、AKT1、JUN、VEGFA、CCND1、MAPK1对接的能量大于-5 kcal·mol-1，其余对接结果均小于-5 kcal·mol-1，证明枳实化合物活性成分和靶蛋白结合稳定，见表2。利用Pymol软件对活性化合物与luteolin结果进行可视化处理，见图7。

图7 分子对接模式图

表2 枳实化合物活性成分和靶蛋白对接结果

3 讨论

乳腺癌属中医“乳岩”“乳石痈”“石痈”等范畴。《医宗金鉴》提出“坚硬岩行引胸腋”，同时指出乳岩是由肝脾两伤和气郁凝结而成的。乳岩辨证以痰瘀互结证、肝气瘀滞证最为常见［7］，治疗需标本兼顾，治以疏肝理气、活血利水。枳实为常用中药材，其味辛、苦，性微寒。《景岳全书》中枳实的功效是“除胀满，消宿食，削坚积，化稠痰，破滞气，平咳喘，逐瘀血停水，解伤寒结胸，去胃中湿热”［8］。研究表明，枳实具有促动力［9］、抗氧化、抗炎［10-11］、抗凝［12］、抗肿瘤、增强细胞免疫［13］等多种活性。目前，未检索到有相关文献对枳实治疗乳腺癌的活性成分、作用靶点、信号通路等作用机制的研究。因此，本研究借助网络药理学平台，构建枳实化合物-靶点网络和PPI网络，并对枳实治疗乳腺癌的靶点进行了GO功能富集分析以及KEGG通路富集分析，进一步分析枳实治疗乳腺癌的机制。

本研究检索到枳实活性成分19个，有对应靶点的成分16个，构建化合物-靶点网络中发现枳实主要通过neohesperidin-qt、luteolin、nobiletin、naringenin、Sinensetin、Tetramethoxyluteolin等有效成分发挥药理学作用。有研究发现，neohesperidin-qt（新橙皮苷）可以诱导MDA-MB-231细胞凋亡［14］。王宏［15］、刘俊磊［16］的实验表明，新橙皮苷有很好的体内外抗肿瘤和抑制肿瘤细胞增殖的作用，联合用药下调了MAPK信号通路的磷酸化活化程度以及Bcl-2和p-AKT表达水平，使核转录因子NF-κB的表达降低。另外，乳腺癌细胞MDA-MB-231中橙皮素抑制CYP1A1和CYP1B表达，刺激INSIG1表达，进而发挥了抗肿瘤的作用。木犀草素已被证实，可显著抑制肿瘤细胞增殖。Zhang等［17］发现，拉帕替尼和木犀草素联合应用可以通过提高HER2人乳腺癌移植瘤中两个关键基因FOXO3a和NQO1的表达以抑制HER2人乳腺癌。由此推断，枳实应用于机体后，它的一些有效成分在肿瘤细胞的生长和转移过程中扮演了重要角色。

Venn分析得到枳实与乳腺癌相关的43个潜在靶点，用Cytoscape软件可视化，得到PPI网络，图中显示Degree值较大者是TP53、AKT1、CASP3、JUN、VEGFA、CCND1、MAPK1，说明它们是药物与疾病相互作用的关键节点。TP53基因改变是最普遍的［18］，它是17号染色体的基因，这是一个十分重要的癌症风险因素。TP53是一种转录因子，当细胞在应激反应中被激活时，调节一系列与细胞过程相关的基因，包括细胞周期、凋亡及衰老［19］。研究证实，受TP53直接调控的miR-34a在乳腺癌、肺癌、肝癌等组织中均有异常的表达，其对肿瘤增殖有负性调控作用，可直接抑制乳腺癌和大肠癌中的乳酸脱氢酶A的表达［20］。在含有TP53错义突变的癌细胞系中，APR-246通过ROS诱导p73和Noxa表达上调，从而诱导显著凋亡［21］。作为高突变率的AKT1基因在肿瘤疾病的发生发展过程中亦起着重要的作用。Li等［22］研究发现，Akt1基因敲除可刺激βcatenin核聚集，导致乳腺癌细胞侵袭，吉非替尼可潜在地抑制Akt1抑制诱导的乳腺癌转移。由此，我们在临床上可根据乳腺癌相关的潜在靶点，针对性用药，可为将来发现新型的治疗药物提供依据。为了进一步研究枳实治疗乳腺癌的作用，利用AutoDock软件做分子对接，结果显示枳实对乳腺癌的多个作用靶点和有效活性成分对接的binding energy小于-5 kcal·mol-1，证明枳实能与乳腺癌受体蛋白稳定结合并发挥重要作用。

本研究对枳实治疗乳腺癌的靶基因进行了GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。GO功能富集分析发现，治疗的生物过程中，主要体现在细胞增殖、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正向调控、一氧化氮生物合成过程、凋亡过程、有毒物质反应等方面，还包括酶结合、相同蛋白结合、转录因子结合、蛋白质异构化活性、激酶活性等分子功能。根据KEGG通路富集分析，枳实与乳腺癌最相关的通路包括PI3K-Akt信号通路、HIF-1信号通路、FoxO信号通路、p53信号通路和雌激素信号通路。Yurasakpong等［23］发现，枳实提取物通过阻断Akt／mTOR／HIF-1轴减少己糖激酶Ⅱ的表达，进而抑制乳腺癌细胞的增长，促进其凋亡。PI3K-Akt信号通路作用显著，肿瘤的发生、增殖、分化、转移和凋亡过程中均起重要作用［24］。通过调节PI3K-Akt信号通路可以干扰乳腺癌增殖和侵袭的能力，诱导细胞凋亡［25-26］，并且与化疗还有协同作用，抑制癌细胞对药物的耐药性［27］。PI3K-Akt信号通路的靶向治疗逐渐成为乳腺癌治疗的热点。

综上所述，本研究采用网络药理学和分子对接的方法，对枳实治疗乳腺癌的多成分、多靶点、多通路机制进行了研究，可体现出中药治疗疾病的复杂性。由于在研究的过程中可能存在数据库资料收集不全面、筛选不够精准等不足之处，故本研究初步探讨了枳实治疗乳腺癌的药理机制，通过生物信息学等技术探究了中药与疾病的潜在作用靶点及机制。