清肝祛湿活血方对非酒精性脂肪肝大鼠肠道菌群的影响∗

张玉香，王一强，姜德民，史晓伟，杜发强

1 甘肃卫生职业学院，甘肃 兰州 730300；2 甘肃省中医院；3 甘肃医学院

近年来，随着人们饮食结构的改变，非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的发生呈现逐年上升趋势。肠道菌群具有代谢、营养、免疫、屏障保护功能［1］。肠道内环境平衡保证了机体健康。动物实验［2］表明，清肝祛湿活血方具有活血化瘀，清肝祛湿等作用。本研究通过大鼠肠道中所含大肠杆菌、乳酸杆菌、肠球菌、双歧杆菌等菌落数变化，观察清肝祛湿活血方对大鼠肠道菌群的影响，阐明该方治疗NAFLD的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物选取体质量（150±20）g 的同批次雄性清洁级SD大鼠90只（购自甘肃中医药大学实验动物中心），实验动物许可证号：SYXK（甘）2011-0001。适应性喂养1周。

1.2 药物清肝祛湿活血方中药煎剂（夏枯草10 g，密蒙花10 g，青葙子10 g，茵陈10 g，垂盆草10 g，丹参15 g，郁金10 g）由甘肃中医药大学药学实验室制备；血脂康（北京北大维信生物科技有限公司，国药准字号Z10950029，规格：0.3 g×36粒）。

1.3 试剂BC琼脂、莫匹罗星锂盐改良MRS培养基、大肠菌群培养基（日本）、肠球菌琼脂均购自青岛海博生物公司。

1.4 仪器IX71-22FL/PH 型奥林巴斯倒置荧光显微镜（上海宣浦化工有限公司）；HH-8 型数显恒温水浴锅（常州市凯航仪器有限公司）；FA1004B型电子天平（上海精密仪器仪表有限公司）；BBSDDC 型单人洁净工作台（博科公司）；LDZF-75KB 型立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；TG-18W型高速离心机（博科公司）；TC-120 型智能程控生物组织自动脱水机（湖北泰维医疗科技有限责任公司）。

1.5 实验方法

1.5.1 动物分组 选取SD 大鼠90 只，随机分为空白组、模型组、血脂康组及清肝祛湿活血方低、中、高剂量组各15只。

1.5.2 造模 常规饲养7 天后，空白组给予普通饲料喂养60 天；其余各组采取聂文山等［3］的造模方法造模，予高脂饲料（84%基础饲料+10%猪油+5%蛋黄粉+1%胆固醇）喂养30天，并于造模后腹腔注射四环素150 mg/kg后每6天腹腔注射1次四环素100 mg/kg，共5 次，并于实验前（0 天）和制模后6、12、18、24、30 天测量大鼠体质量，并根据体质量调整给药剂量，第30 天造模成功（预试验造模，共计12 只大鼠，每组2 只，造模后每组选取1 只进行肝组织病理切片，染色后有明显的肝细胞脂肪变性，肝小叶结构紊乱，局灶性肝细胞坏死，淋巴细胞浸润，证明预试验造模成功）。在有氧、无菌条件下通过按摩刺激大鼠腹部使其尽快排便，将粪便盛于严格灭菌的EP管内，−20℃保存备用。

1.5.3 给药 造模结束后，即第31 天开始，参照《药理实验方法学》，大鼠用药量应为成人用药量的9 倍［3］。换算出大鼠对应中剂量给药量应为11.25 g生药/kg。清肝祛湿活血方高、中、低剂量组分别给予22.5 g、11.25 g、5.63 g生药/kg，血脂康组给血脂康混悬液0.1 g/kg。各组连续给药30天，空白组与模型组每日灌胃等体积蒸馏水1次。

1.5.4 标本采集与指标检测 第61 天开始，即最后1 次给药24 h 后，无菌条件下消毒大鼠腹部，取盲肠和直肠中的粪便，同时取出−20℃保存的粪便4℃解冻，解冻时间不能超过18 h。在超净套上取各组大鼠粪便，置于灭菌硫酸纸上称重，然后放入带玻璃珠的干燥灭菌小试管中，按文献［4］方法稀释后分别接种于各自对应的培养基上，计数各培养基菌落数目，并对双歧杆菌、乳酸杆菌、肠球菌、大肠杆菌进行菌群分析。

1.6 统计学方法采用SPSS 19.0 分析数据，以±s表示，组内比较采用单因素方差分析和t检验；组间比较采用多组间方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 双歧杆菌与乳酸杆菌菌落数与空白组比较，给药前各组双歧杆菌与乳酸杆菌数量降低（P＜0.05）。与模型组比较，给药后血脂康组及清肝祛湿活血方低、中、高剂量组双歧杆菌与乳酸杆菌数量增加（P＜0.05）。见表1—2。

表1 各组大鼠粪便中双歧杆菌菌落数比较（±s） logCFU/g

表1 各组大鼠粪便中双歧杆菌菌落数比较（±s） logCFU/g

注：*表示与空白组比较，P＜0.05；#表示与模型组比较，P＜0.05

组别空白组模型组血脂康组清肝祛湿活血方低剂量组清肝祛湿活血方中剂量组清肝祛湿活血方高剂量组鼠数15 15 15 15 15 15剂量（g/kg）--0.10 5.63 11.25 22.50给药前9.24±0.47 8.95±0.44*8.92±0.43*8.94±0.82*8.90±0.62*8.92±0.59*给药后9.20±0.40 8.99±0.29*9.32±0.56#9.28±0.35#9.39±0.36#9.45±0.48#

2.2 肠球菌与大肠杆菌菌落数与空白组比较，给药前各组肠球菌与大肠杆菌数量增加（P＜0.05）；给药后，与模型组比较，血脂康组及清肝祛湿活血方低、中、高剂量组肠球菌与大肠杆菌菌落数减少（P＜0.05）。见表3—4。

表2 各组大鼠粪便中乳酸杆菌菌落数比较（±s） logCFU/g

表2 各组大鼠粪便中乳酸杆菌菌落数比较（±s） logCFU/g

注：*表示与空白组比较，P＜0.05；#表示与模型组比较，P＜0.05

组别空白组模型组血脂康组清肝祛湿活血方低剂量组清肝祛湿活血方中剂量组清肝祛湿活血方高剂量组鼠数15 15 15 15 15 15剂量（g/kg）--0.10 5.63 11.25 22.50给药前8.59±0.12 8.42±0.52*8.44±0.43*8.43±0.22*8.39±0.11*8.46±0.23*给药后8.57±0.35 8.44±0.26*8.77±0.36#8.69±0.25#8.79±0.39#8.85±0.55#

表3 各组大鼠粪便中肠球菌菌落数比较（±s） logCFU/g

表3 各组大鼠粪便中肠球菌菌落数比较（±s） logCFU/g

注：*表示与空白组比较，P＜0.05；#表示与模型组比较，P＜0.05

组别空白组模型组血脂康组清肝祛湿活血方低剂量组清肝祛湿活血方中剂量组清肝祛湿活血方高剂量组鼠数15 15 15 15 15 15剂量（g/kg）--0.10 5.63 11.25 22.50给药前8.64±0.47 8.95±0.44*8.92±0.43*8.94±0.82*8.90±0.62*8.92±0.59*给药后8.61±0.40 8.99±0.29*8.32±0.56#8.28±0.35#8.39±0.36#8.45±0.48#

表4 各组大鼠粪便中大肠杆菌菌落数比较（±s） logCFU/g

表4 各组大鼠粪便中大肠杆菌菌落数比较（±s） logCFU/g

注：*表示与空白组比较，P＜0.05；#表示与模型组比较，P＜0.05

组别空白组模型组血脂康组清肝祛湿活血方低剂量组清肝祛湿活血方中剂量组清肝祛湿活血方高剂量组鼠数15 15 15 15 15 15剂量（g/kg）--0.10 5.63 11.25 22.50给药前7.15±0.26 7.31±0.44*7.35±0.56*7.29±0.27*7.30±0.36*7.34±0.48*给药后7.19±0.40 7.34±0.46*6.43±0.66#6.36±0.42#6.45±0.33#6.56±0.52#

3 讨论

肠道菌群是一个庞大的肠道内系统，是人体最大的免疫器官，大约存有1.5 千克细菌，肠道菌群的存在直接影响宿主能量代谢、营养及免疫等，所以常被人们称为“第二基因组”［6］。本研究选取了大鼠肠道内双歧杆菌和乳酸杆菌两种益生菌，以及肠球菌和大肠杆菌两种病原菌研究清肝祛湿活血方对NAFLD大鼠肠道菌群的调节作用。每个宿主其疾病的发生、发展和生理代谢都受肠道菌群的影响，在此过程中肠道菌群起重要作用［7］。其中双歧杆菌及乳酸菌对机体免疫功能、生长发育、营养供给、抗衰老及感染等过程发挥重要作用［8］。宿主肠道中的肠球菌和大肠杆菌属兼性菌，不对机体健康产生副作用，但是如果在各种原因影响下，其迁移或增殖过程失控破坏了机体肠道菌群平衡，就会导致产生疾病［9］。

NAFLD被认为是代谢综合征的肝脏表现[10-12]。相关研究证实[13-15],血脂康治疗非酒精性脂肪肝疗效显著确切，安全可靠，被临床广泛应用。因此，本实验选用血脂康作为阳性对照药物来对比清肝祛湿活血方的治疗效果。根据实验结果，血脂康组与清肝祛湿活血方低剂量组效果相似，但无清肝祛湿活血方中、高剂组效果好。

清肝祛湿活血方中夏枯草清肝散郁；密蒙花清热泻火，养肝明目；青葙子清肝凉血；茵陈清热利湿、退黄；垂盆草清热解毒、利胆；丹参、郁金散结化瘀，行气通络。诸药合用活血化瘀，清肝祛湿［16-17］。本研究结果显示，清肝祛湿活血方能够促进大鼠肠道内乳酸杆菌和双歧杆菌增殖，抑制大肠杆菌、肠球菌增殖，说明清肝祛湿活血方具有肠道菌群调节作用。