不同方法检测淋球菌的临床应用评价

韩 磊，杨丽娟，曹守勤

淋病是由淋病奈瑟菌(简称淋球菌)感染引起的以泌尿生殖系统、化脓性感染为主要特征的一种性传播疾病，如不及时治疗可向周围组织扩散引起各类相应的并发症和后遗症[1]。因此，探讨淋球菌特异性和敏感性的检测方法以及对抗菌药物的敏感性程度具有重要意义。本文将宁夏银川市妇幼保健院性病门诊以及妇科门诊就诊的300例宫颈或尿道分泌物标本进行直接涂片镜检法、分离培养鉴定法和荧光定量PCR法检测，比较检测结果，从而为临床检测和治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料：选取2018年1月至2019年12月在宁夏银川市妇幼保健院性病门诊以及妇科门诊就诊的患者300例，其中男性患者120例，女性患者180例，年龄在18～60岁之间，平均年龄为(28.9±3.6)岁。选取同期于我院健康体检者100例为健康对照组，其中男性体检者25例，女性体检者75例，年龄在22～65岁之间，平均年龄为(31.7±7.6)岁。

1.2 标本采集：男性以无菌拭子采集尿道口分泌物送检，女性取宫颈分泌物送检。 将拭子插入男性尿道口或女性宫颈口2～3 cm，旋转2～3周并停留5～10 s 后取出；尿道口出现分泌物时，可直接用棉拭子醮取分泌物送检。所有样品均采样一式三份，分别置于无菌采样管中并立即送检[2]。

1.3 仪器与试剂

1.3.1 仪器：光学显微镜是日本生产的OLYMU型，CO2培养箱是芬兰生产的 2306型，生物安全柜是美国生产的LABCONCO型，实时荧光定量PCR是罗氏诊断公司生产的。

1.3.2 试剂：T-M培养基购自杭州滨河微生物试剂有限公司、革兰氏染液购自bioMerieux sa公司，氧化酶试剂购自珠海迪尔生物工程有限公司，糖发酵管购自杭州滨河微生物试剂有限公司，PCR试剂盒购自中山大学达安基因股份有限公司，试剂均在有效期内。

1.4 检测方法[3]

1.4.1 直接涂片法：将拭子在载玻片上轻轻滚动涂片，在室温中自然干燥，经火焰固定，再进行革兰氏染色，待干，油镜下在脓细胞内外查找形态典型的革兰氏阴性双球菌。

1.4.2 培养法：在T-M培养基上，用接种环从涂有分泌物处进行四区划线分离接种。在35～36 ℃、湿度大于70%、5%CO2培养箱培养，孵育24～48 h可出现疑似菌落。

1.4.3 鉴定标准：根据菌落形态挑取可疑菌落，涂片固定后进行革兰氏染色，油镜下寻找革兰氏阴性双球菌，然后做氧化酶试验为阳性者，初步鉴定为淋球菌，再做淋球菌生化试验(葡萄糖产酸不产气，不发酵麦芽糖、蔗糖和乳糖)，最后鉴定是否为淋球菌。

1.4.4 荧光定量PCR法：试剂盒为中山大学达安基因股份有限公司生产的淋球菌核酸扩增(NGH-DNA)检测试剂盒；扩增仪为罗氏诊断公司生产的LightCyclerR480Ⅱ型实时荧光定量PCR仪。检测方法严格按照试剂盒的操作说明书和本中心性病实验室的SOP要求进行操作。淋球菌标准菌株由宁夏疾病预防控制中心提供，作为试验的阳性对照菌株使用。

1.5 统计学方法：采用SPSS 17.0统计软件，计数资料采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

以传统的分离培养法结果作为检测淋球菌的“金标准”，直接涂片法检测的灵敏性和特异性分别为75.0%和92.0%；荧光PCR法检测的灵敏性和特异性分别为95.0%和89.0%。荧光PCR法检测的敏感性明显高于直接涂片法，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 不同方法检测淋球菌检测结果比较

3 讨论

淋病是目前国内广泛流行的性传播疾病(STD)之一，其病原体为淋球菌，它是一种严格的人体寄生菌，存在于急慢性尿道炎和阴道炎的脓性分泌物及新生儿眼分泌物中，可引起女性的不育症、宫内感染、流产、早产甚至死胎以及新生儿失明[4]等严重疾病。同时，在发病过程中可诱发附睾炎、盆腔炎等，对患者的身心健康带来了较大的伤害，因此，对于淋病奈瑟菌的早期诊断至关重要。近年来，淋球菌病原体的发病率在我国虽然没有梅毒感染率高，但也是梅毒之后的第二大性传播疾病[5]。淋病感染者多数临床症状较轻或无临床症状，不容易引起感染淋病的人重视，甚至滥用抗生素的治疗等，因此常常导致隐匿感染，慢性持续感染状态及带菌状态[6]，容易在性伴侣之间交叉传播。因为淋球菌感染有机会在性伴之间交叉传播，人们对STD的认知有所提高，在性病门诊和妇科门诊就诊的患者会要求进行淋球菌检测。因此我院应该选择临床上更适合淋球菌检出的检验方法，对性病门诊患者进行淋球菌筛查，早发现、早治疗甚至减少慢性感染与并发症发生率显得更为重要[7]。

本研究发现，以分离培养法作为诊断淋球菌的“金标准”，直接涂片法的敏感性(75.0%)，明显低于荧光PCR法的敏感性(95.0%)，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1，与国内文献报道基本一致[8]。这有可能是患者曾经治疗过或者不愿去医院进行正规治疗，使患者的病情减轻或转化成慢性炎症，以致淋球菌数目减少，分泌物中其他杂菌干扰导致的。

淋球菌的实验室检测方法多种多样，不同的检测方法有各自的优缺点和各自的使用范围，本文主要研究了临床上比较常用的三种检测淋球菌的方法。分离培养法是WHO推荐的检测和诊断淋球菌的“金标准”，但淋球菌营养要求较高，对外界环境中的湿度、温度等抵抗力比较差，离体后容易死亡和自溶，另外在性病门诊和妇科门诊采集的分泌物有时不能及时送检会出现不合格的标本，此外分离培养的时间需要数日，容易耽误病情。传统的直接涂片法操作简单，也不需要特殊的仪器，结果直观、快速，候诊时间短，费用低，能够起到临床提示再用，但女性标本受多种因素的影响，结果易出现假阳性，因此对检验人员的检测技术和临床经验要求较高。荧光PCR法虽说具有灵敏度高、特异性强、准确和快速等特点，但是也容易出现假阳性结果，要严格按照PCR的SOP进行操作，建立防污染措施，防止残留污染和标本间扩增序列交叉感染，试验全过程一定要设立阴、阳性对照[9]，所需费用较高，无法在基层医院普遍适用。

淋病是危害人类身体健康的重要性病之一，随着人们思想意识的开放，人口流动的加剧，淋病的发病率逐年增加，淋病的防治已成为十分重要的社会和医学问题。实验室应选择一种快速，且敏感性和特异性好的方法，以便能尽早、准确地诊断淋病[10]。本文认为，我院检验科对疑似病例先后采用直接涂片法和荧光PCR法检测，基本能够满足临床需要；对于慢性或者治疗后的患者，我们宜采用分离培养法。选择正确的检测方法，结合患者的病史、临床表现及淋病治疗情况等进行综合分析，及早、准确地为淋病诊断和治疗提供重要的依据。