CRP基因rs3093068位点多态性与缺血性卒中危险因素及卒中结局的相关性研究

石延枫，程丝，许喆，刘阳，李昊，王拥军，3

CRP升高作为全身炎症和内皮炎症反应的敏感标志物，是卒中发生和发展的独立危险因素[1-5]。研究CRP基因相关的遗传变异与卒中危险因素及卒中结局的相关性，有助于了解卒中进展并探索潜在的治疗靶点[6-9]。维生素干预预防卒中（vitamin intervention for stroke prevention，VISP）临床试验队列分析发现，rs3093068位点与外周血CRP水平以及卒中复发相关[8]。然而，该研究纳入的主要是非裔美国人，未在中国人群中研究，且样本量仅为2100例。此外，rs3093068位点和卒中相关危险因素的相关性以及与卒中结局（卒中复发、联合血管事件和不良功能结局）的系统性研究尚缺乏报道。本研究基于中国国家卒中登记Ⅲ（China national stroke registry-Ⅲ，CNSR-Ⅲ）队列遗传亚组中的7773例首次发生缺血性卒中或TIA的患者，系统性分析了rs3093068位点不同基因型与已知的缺血性卒中危险因素以及各亚型结局的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象 本研究基于全国多中心前瞻性CNSR-Ⅲ队列[10-11]，连续纳入2015年8月-2018年3月入组的14 146例缺血性卒中患者和1020例TIA患者。CNSR-Ⅲ入组标准：年龄≥18岁；缺血性卒中或TIA；发病至入组时间≤7 d。其中，12 603例患者参与了预先设计的遗传亚组研究。入组患者覆盖全国22个省和4个直辖市的201所医院。所有患者均签署知情同意书，本研究获得首都医科大学附属北京天坛医院医学伦理委员会批准（批准文号：KY 2015-001-01）。

1.2 纳入排除标准 纳入标准：①CNSR-Ⅲ中参与了预先设计的遗传亚组研究的患者；②既往无缺血性卒中病史；③提供了基线血样并且提取的DNA含量足够。本研究排除了病因学分型为其他确定病因型的卒中患者。

1.3 资料收集与定义 通过CNSR-Ⅲ临床数据库提取患者基线信息：①人口特征信息，包括年龄、性别、BMI；②既往史，包括吸烟、饮酒、高血压、糖尿病、血脂异常、心房颤动、冠心病；③发病诊断相关信息，包括卒中发病类型、入院时NIHSS、卒中病因学分类（causative classification of stroke，CCS）系统亚型[12]；④血液标志物，包括hs-CRP、LDL-C。其中hs-CRP及LDL-C检测为中心化统一检测。

重度饮酒者：每日≥2倍标准饮酒量。高血压：收缩压≥140 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）和（或）舒张压≥90 mmHg以及使用任何降压药物或患者自述的高血压病史；糖尿病：入院时或在住院期间空腹血糖≥7.0 mmol/L，或患者自述病史以及医师诊断的糖尿病，或患者有使用降血糖药物史；血脂异常、心房颤动和冠心病定义为患者自述或医师诊断疾病史，或住院期间被诊断此疾病。

使用C C S系统对患者进行卒中病因学亚型分型，包括大动脉粥样硬化型（largeartery atherosclerotic，LAA）、心源性栓塞型（cardioembolic，CE）、小动脉闭塞型（small a r ter y occ lusion，SAO）、其他确定病因型（other common causes，OC）和病因未明型（undetermined causes，UC）。

1.4 卒中随访结局 CNSR-Ⅲ队列采用中心化随访，由首都医科大学附属北京天坛医院随访中心经过统一规范化培训后的随访人员在患者发病后1年进行随访（发病3个月和1年时采用面对面随访，发病6个月时采用电话随访）。从患者的就诊医院采集卒中复发和联合血管事件发生的信息，由独立终点判断委员会判断未住院患者的疑似事件。卒中复发定义为1年随访期间，患者再次发生新的缺血性卒中或出血性卒中。联合血管事件包括缺血性卒中、出血性卒中、心肌梗死和1年随访期间的血管性死亡。不良功能结局定义为1年随访时mRS≥3分。

1.5 基因型检测 使用竞争性等位基因特异性PCR（kompetitive allele-specific PCR，KASP）对rs3093068位点进行基因型检测[13]。同时，为保证基因型检测的准确性，随机选择10例患者的DNA，采用Sanger测序技术同时检测rs3093068位点，两种方法间的一致性＞95%。

2 结果

2.1 患者筛选 CNSR-Ⅲ队列共纳入15 166例患者，其中12 603例参与了遗传亚组的研究，10 227例患者采用KASP进行基因型检测，排除100例rs3093068位点基因型检测失败以及2292例有缺血性卒中病史的患者，再将7835例患者中CCS分型为OC亚型的62例患者排除，最终纳入分析的患者共7773例（图1）。

CNSR-Ⅲ-中国国家卒中登记Ⅲ；KASP-竞争性等位基因特异性PCR；LAA-大动脉粥样硬化型；CE-心源性栓塞型；SAO-小动脉闭塞型；OC-其他确定病因型；UC-病因未明型。

2.2 rs3093068位点基因型携带者基线资料与卒中危险因素分析 rs3093068位点GG、GC和CC基因型携带者的频数和比例分别为5334例（68.62%）、2196例（28.25%）和243例（3.13%）。rs3093068位点GG、GC、CC基因型携带者的hs-CRP中位水平分别为1.53（0.75～4.07）mg/L、2.04（1.00～5.14）mg/L、2.75（1.30～6.62）mg/L，不同基因型患者血液hs-CRP水平差异有统计学意义（P＜0.001），其余基线指标（性别、年龄、BMI、目前吸烟者比例、重度饮酒者比例、入院时NIHSS＞3分者比例、相关病史比例及LDL-C水平）之间的差异均未达到统计学意义。此外，统计不同基因型在卒中亚型分析中的差异发现，各亚型中GG、GC和CC基因型携带者的比例差异无统计学意义（表1）。

表1 rs3093068位点不同基因型患者的基线特征

2.3 rs3093068位点基因型在不同卒中结局中的分布 该位点的次要等位基因频率（minor allele frequency，MAF）为17.2%，经χ2检验，该位点符合HWE检验（χ2=0.857，P=0.362）。对该位点在不同结局中的分布统计发现，GG、GC和CC基因型在1年随访卒中复发、联合血管事件以及不良功能结局事件中的分布差异无统计学意义（表2）。

表2 rs3093068位点基因型在不同结局分组中的分布情况

2.4 rs3093068位点基因多态性与卒中结局的关系 在加性、显性及隐性3种遗传模型中，未发现rs3093068位点基因多态性与卒中复发、联合血管事件、不良功能结局3种卒中结局的相关性；在校正年龄、性别、心房颤动、入院NIHSS和联合血管事件后，rs3093068位点基因多态性与3种卒中结局仍不相关（表3）。

表3 rs3093068位点基因多态性对卒中结局发生的影响

2.5 rs3093068位点基因多态性与不同亚型卒中结局的关系 按照CCS分型，对rs3093068位点基因多态性与卒中不同亚型的结局进行分层分析。结果发现，在加性和隐性模型下，经多因素校正后，CC基因型与病因未明型卒中的不良功能结局相关，CC基因型携带者不良功能结局的风险分别为2.19（95%CI1.01～4.41）和2.29（95%CI1.06～4.57）；未发现该位点与其他亚型预后的相关性（表4）。

表4 rs3093068位点基因多态性对不同亚型卒中结局发生的影响

3 讨论

本研究系统地分析了CRP基因rs3093068位点基因多态性与缺血性卒中危险因素以及不同亚型结局之间的相关性。rs3093068位点（g.159711574 C＞G）位于CRP基因间区[14]，曾被报道与缺血性卒中的发生有关，但未表明是否与卒中的进展相关，本研究发现该位点的次要等位基因与病因未明型卒中的不良功能结局相关。

既往研究发现rs3093068位点与缺血性卒中的发生风险相关。研究发现，rs3093068、rs16842599和rs11265260位点和缺血性卒中的发生和复发相关[8]，但该研究未对卒中亚型进行分析且未分析患者的不良心血管事件以及不良功能结局等预后。对缺血性卒中相关危险因素的分析发现，rs3093068位点不同基因型患者血液中hs-CRP水平有明显差异，证实了在中国人群中该位点和hs-CRP水平的关联，也提示该位点与卒中结局关联的机制可能与其介导的炎症相关通路有关[15-20]。den Hertog等[21]的研究发现，CRP基因上3个位点（包括rs1130864：C＞T，rs1205：C＞T和rs3093068：C＞G）的CRP单倍型中的CCG单倍型与缺血性卒中患者血液中CRP水平相关。Reitz等[22]关于CRP单倍型和血清CRP水平以及老年人脑小血管病风险的相关研究发现，rs3093068位点的CC、CG和GG基因型频率分别为87.6%、9.1%和0.9%，其主要基因型为CC，与本研究显著不同；此外，该研究纳入的1303例样本主要来自荷兰和德国，提示了不同种族该位点的不同；与血清CRP水平和脑小血管病的相关性分析发现，CCG单倍型与血清CRP和脑小血管病风险均无统计相关性。Ridker等[23]关于介导代谢综合征通路基因上的多肽位点与妊娠糖尿病及其长期影响相关研究发现，rs3093068位点与血浆CRP水平显著相关，并且发现CRP基因上多个单核苷酸多态性（single

nucleotide polymorphism，SNP）位点与调控糖尿病和早期动脉粥样硬化形成相关的信号转导途径相关，提示该位点可能参与调节血脂相关基因，但本研究未发现其与LDL-C的相关性。可见目前关于rs3093068多态性与CRP水平及脑血管病的研究在不同人群中的结论不一致，这可能与不同地区、不同种族人群基因型分布的差异性有关。除hs-CRP因素外，本研究的rs3093068位点与患者BMI、高血压、冠心病、糖尿病、LDL-C水平以及血脂异常均无一定关联，表明该位点与卒中结局之间的关联可能不是通过这些危险因素介导的。

本研究有助于病因未明型卒中预后的风险评估，对于理解遗传因素在病因未明型卒中进展和预后中的作用及探索潜在的治疗靶点有重要意义，提示了后续研究应关注rs3093068位点与危险因素相互作用的相关机制。本研究存在以下局限性：第一，本研究所发现的rs3093068位点与hs-CRP水平及病因未明型卒中不良功能结局的相关关系不能解释其因果关系；第二，不同亚型卒中的结局可能由不同的遗传和环境因素影响，本研究所发现的rs3093068位点与卒中结局关联结果的具体机制尚需进一步探索；第三，本研究是基于CNSR-Ⅲ的子队列研究，其中患者主要来自城市环境，可能不代表整个中国卒中患者群体。

【点睛】本研究系统分析了CRP基因rs3093068位点与卒中结局及危险因素的相关性，发现该位点与病因未明型卒中的不良功能结局之间存在相关性。