一种姬松茸菌床常见病害的病原菌分离鉴定*

华 蓉，李建英，刘绍雄，罗孝坤，李雪松，熊永生，孙达锋**

（1.中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221；2.云南省食用菌产业发展研究院，云南 昆明 650221）

姬松茸（Agaricus blazei）又名巴西蘑菇、柏拉氏蘑菇、巴氏蘑菇、小松菇等，原产于巴西、秘鲁、美国等地，我国鲜见有关野生资源的报道。野生姬松茸夏秋季节生长在林地或草地，属草腐菌，分类学上隶属担子菌门（Basidiomycota）伞菌纲（Agaricomycetes）伞 菌 目 （Agaricales）伞 菌 科 （Agaricaceae）伞菌属 （Agaricus）[1]。姬松茸味道鲜美，具有独特的杏仁香味，口感极好、营养丰富，食用价值较高。含有丰富的氨基酸、蛋白质、维生素、矿质元素、多糖、活性核酸、活性甾醇类和外源凝集素等物质，有一定的降血脂、降血糖、降低低密度脂蛋白、抗癌、抗氧化、抗衰老、防治糖尿病、增强机体免疫力、抗疲劳等功效[2-5]。姬松茸因食用价值和药用价值均很高，受到广大消费者的喜爱，近年来也成为国内外的重点研究对象，作为材料被制成酸奶、即食产品、饼干、面条、保肝胶囊、复方口服液、多糖分散片等多种功能食品、医疗用品和保健品[6-12]。

1965年日本人古本隆寿成功分离菌种后开始了姬松茸的栽培研究，1978年开始进行商业化栽培；我国福建省农业科学院1992年从日本引进姬松茸菌株试种成功，后逐步推广至全国[13-14]。多年来，我国姬松茸产量呈现稳步上涨的趋势，具中国食用菌协会统计，2010年我国姬松茸产量为2.87万吨，2019年达到了12.11万吨；福建是第一个栽培姬松茸的省份，也一直是全国产量最大的省份；然而近年来随着云南省食用菌产业的快速发展，2019年云南省姬松茸产量达4.91万吨，位居全国第一[15]。2020年12月19日，云南省食用菌协会姬松茸分会的成立更是提高了中国姬松茸的国际知名度，提升了我国食用菌国际市场影响力和竞争力[16]。

目前姬松茸的主要栽培方式为发酵料覆土栽培，基料养分对产量有决定性影响。在实际栽培中，栽培户发现基料易感染一种霉菌，其与基料长在一起呈灰色，具有可见霉层，轻拍有粉末状孢子弹出，此病症被称为“灰霉病”。发生病害后病原菌扩散速度快，处理不及时会大量消耗基料中的养分，影响姬松茸的产量。文山是云南省姬松茸栽培的主要产地，也是“灰霉病”病害较为严重的区域。通过从文山姬松茸栽培主产地采集病害样品，分离纯化出病原菌并进行鉴定，以期为“灰霉病”的生物防治提供参考依据，为姬松茸菌种选育筛选抗病性菌株提供供试菌株材料。

1 材料与方法

1.1 姬松茸病害调查和样品采集

1.1.1 样地概况

文山市滇珍菌业有限公司为云南省内最大的姬松茸栽培企业，为本次病害调查地和研究样本采集地。具体样点为文山市滇珍菌业有限公司姬松茸栽培大棚。

1.1.2 病害调查和样品采集

病害情况：播种后约6天，菌床开始出现病害，菌床表面呈现灰色霉层，强光下仔细观察可见浅桔色粉末状孢子层；天气干燥时病害较少，开棚晚、湿度较大的情况下病害较严重，下雨后病害会加重；四层架的最上层情况相对严重；往年出现过病害的大棚，后续栽培过程中病害更易发生；病害发生后，开边窗、降湿度能在一定程度上缓解症状。

样品采集时间为2021年5月17日，在3个病害严重的大棚中随机采集覆满病原菌菌丝的基料样品3份，并进行编号（1～3），装入样品采集袋中，用冰盒保存带回实验室进行病原菌分离。

1.2 姬松茸病原菌分离鉴定

1.2.1 培养基制备

从病害情况调查结果可知，病害部位有明显的真菌菌丝和孢子层，初步判断此病害是由真菌感染引起。因此病原菌分离采用孟加拉红培养基，纯化、培养采用PDA培养基[17]。

孟加拉红培养基：琼脂15 g～20 g、葡萄糖10 g、蛋白胨5 g、磷酸二氢钾1.0 g、硫酸镁0.5 g、氯霉素0.1 g，1/3 000孟加拉红100 mL，蒸馏水1 000 mL。

PDA培养基：马铃薯200 g、琼脂15 g～20 g、葡萄糖20 g，蒸馏水1 000 mL。

1.2.2 病原菌分离与纯化

在超净工作台进行无菌操作，挑取病原菌包裹的少量基料，接种在孟加拉红培养基平板上，置于24℃培养箱中进行避光培养。培养3 d～5 d后，挑取病原菌菌落边缘部分菌丝或带菌丝的培养基至PDA平板上进行纯化，重复此操作至获得单一菌落。对3个样品进行相同的操作，获得的纯菌株命名为HMB-1～HMB-3。放置于4℃冰箱中保存，备用。

1.2.3 真菌菌株的分子鉴定

采用ITS序列分析法[18-20]对纯化的菌株HMB-1～HMB-3进行分子鉴定，样品送至昆明硕擎生物科技有限公司进行DNA提取、扩增和测序。用DNASTAR软件对双向序列进行拼接处理，用DNAman软件对病原菌序列进行相似度比对。在NCBI数据库中进行BLAST序列比对，并下载与样品序列相似度较高的序列，用MEGA 6软件构建系统发育树，确定菌株的系统学发育地位。

2 结果与分析

2.1 姬松茸病害调查结果与分析

本次研究的病害为姬松茸栽培过程中的常见病害，病害发生后如处理不及时，病害会快速扩散，病原菌与姬松茸菌丝竞争消耗基料中的养分，影响姬松茸的产量。据调查，大棚开棚晚、通风不良，加上降雨后湿度大的情况下较易发生病害。层架中的最上面一层温度较高、病害较严重，说明氧气不足、高温高湿的条件下病害更易发生，通风、降湿是缓解病害的有效手段。往年出现过病害的大棚发生病害的几率更大，因此在每年栽培料进棚前应对大棚进行充分的清洁消毒，保障周边环境干净整洁，尽量减少病害的再次发生。

2.2 病原菌分离鉴定

姬松茸菌床感染病害情况见图1。

图1 感染病害的姬松茸菌床发病症状Fig.1 Symptoms of Agaricus blazei infected with the disease

如图1所示，为姬松茸菌床发病症状（位于菌床层架下方），将覆满病原菌菌丝的姬松茸菌床基料3个样品进行病原菌分离，在PDA培养基上24℃培养4 d获得纯培养菌株，结果见图2。

图2 病原菌菌株菌落形态Fig.2 Colony morphology of pathogen

如图2所示，菌落圆形，中间桔色，有明显的孢子层，边缘白色，气生菌丝贴于培养基生长。3个菌株 （HMB-1～HMB-3）菌落形态一致。

2.3 病原菌菌株的ITS序列分析

经过DNA提取、扩增、测序和双向序列校对，菌株HMB-1～HMB-3的ITS序列片段大小分别为560 bp、565 bp、567 bp。用DNAman软件对3条序列进行比对，发现将3条序列两端处理后剩余559 bp，相似度为100%，结合菌落形态一致性，可以确定3个样品中分离到的3个菌株为同一种病原菌。

将序列在GenBank数据库（NCBI）中进行BLAST比对。下载相似度高（100%），且已在期刊发表的粉红聚端孢菌（Trichothecium roseum）的3条序列 （JQ434579.1，KR559032.1，KT758800.1），以及聚端孢属（Trichothecium）中其他种已发表的ITS序列作为参照，选取覆土型食用菌栽培中常见的杂菌米根霉 （Rhizopus oryzae）（MH865593.1）作为外群，使用Neighbor-Joining方法构建系统发育树，确定菌株的系统学分类地位，详见图3。

图3 基于ITS序列构建的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree based on ITS sequences

由图3可见，3个病原菌菌株（HMB-1～HMB-3）与聚端孢属（Trichothecium）序列聚在一个支系上，且与粉红聚端孢菌（T.roseum）在同一支，且支持率为99%，因此，可以确定样品中分离到的3个病原菌菌株为粉红聚端孢菌。

3 结论与讨论

3.1 结论

通过研究，从3个病害严重的大棚中采集到的样品里分离纯化出3个真菌菌株HMB-1～HMB-3。3个菌株的菌落形态一致，均为圆形，中间桔色、边缘白色，气生菌丝贴于培养基生长。用DNAman软件对3条序列进行比对，3个菌株序列相似度为100%，结合形态一致性可以确定3个菌株为同一种病原菌。经过BLAST比对、构建系统发育树，确定本次研究分离到的3个病原菌菌株为粉红聚端孢菌。

3.2 讨论

本次研究的姬松茸病害虽被栽培户称为“灰霉病”，但其实真正的灰霉病是由葡萄孢属（Botrytis）真菌侵染植物引起的一种世界性植物真菌病害，因致病菌会在植物组织表面产生大量灰色霉层而得名，主要危害蔬菜、水果和花卉等200多种农作物[21-22]。相应的研究和防治措施很多。截至2020年4月，我国登记防治灰霉病的杀菌剂商品就有471个；以防治茄科、葫芦科、葡萄科、蔷薇科等经济作物为主，除了蔬菜水果以外，百合、菊花、牡丹等一些观赏性花卉，以及人参等具有较高经济价值的作物也有少量商品登记[22]。

本次研究的病害虽在棚内呈现灰色霉层，但在强光下可见浅桔色。从菌落形态和分子系统学分析确定本次引起病害的病原菌为粉红聚端孢菌。因此，此次研究的姬松茸大棚病害不是灰霉病，而是由粉红聚端孢菌引起的一种竞争性新型病害。粉红聚端孢菌菌丝生长温度范围为10℃～35℃，最适温度为25℃，在pH 3～8都能生长，最适生长pH为6[23]，与姬松茸的生长条件十分接近，可能也是粉红聚端孢菌易造成姬松茸栽培病害的原因之一。

粉红聚端孢菌是引起木瓜、梨、香蕉、葡萄等多种水果红粉病、棉花红腐病和苹果霉心病等病害的重要病原真菌[24]。对粉红聚端孢菌引起的植物性病害及其防治措施的研究有很多[25]，但食用菌中的粉红聚端孢菌病害报道和防止措施都比较少。2013年董文慧[26]首次报道了红聚端孢菌是引起鸡腿菇菌柄溃疡病的病原菌，并证实50%咪鲜胺锰盐（WP）在对鸡腿菇菌丝影响较小的前提下对粉红聚端孢菌有较好的抑制作用；王刚正等[27]研究报道了大蒜 （Allium sativum）提取液对粉红聚端孢菌有较好的抑制作用；之后未见其他相关报道。

由于食用菌菌丝对药物敏感度较高，且粉红聚端孢菌和食用菌同属于真菌，在药物防治上相对于植物病害要更为艰难，也需要更加谨慎。栽培户在姬松茸粉红聚端孢菌病害发生后，曾使用菌核净或是氟啶胺和喹啉铜的混合剂喷洒，对病原菌菌丝有明显的抑制作用，但药物对姬松茸菌丝的影响、用药剂量等都缺乏确切的数据，需要开展更多的研究。本次研究中首次发现粉红聚端孢菌能够引起姬松茸病害，为今后姬松茸栽培病害防治提供了更多的依据，为姬松茸菌种选育筛选抗病性菌株提供了供试菌株材料，也为后期食用菌中粉红聚端孢菌病害的药剂开发奠定了基础。