一株内蒙古自治区蘑菇科新种的初步研究*

李亚娇，孙国琴**，于传宗，王海燕，庞 杰，郭九峰

（1.内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010031；2.内蒙古大学物理科学与技术学院，内蒙古 呼和浩特 010021）

随着人们生活水平不断提高，各年龄段人们追求的生活品质不断提升。由于食用菌味道鲜美、风味独特，且具有很高的营养保健及药用价值，成为现代人们青睐的餐桌食品，野生食用菌更是倍受学者及消费者关注，具有良好的开发应用前景[1-3]。我国是野生食用菌资源最丰富的国家之一，据统计，全世界已知的食用菌有2 000多种，我国已被鉴定的约有近1 000种，其中有100多种被驯化，用于商业栽培的有60多种[4-5]。然而，还有很多具有极高食（药）用价值的食用菌资源仍未被挖掘。近年来，由于野生菌市场火热，利益驱使人们乱采乱挖、过度采集；加之生态环境退化，致使野生食用菌资源量逐年递减，许多品种濒临灭绝，因此，急需对野生菌资源进行驯化保育工作。

将形态学和分子生物学（如DNA分子标记技术）相结合，由表及里的对野生菌进行深层次的基因挖掘，从本质上进行鉴定。DNA分子标记技术具有快速、准确的优点[6-7]，能够对形态差异较小的种间及种内菌株进行鉴别[8]。常用的食用菌DNA分子标记方法主要有随机扩增多态性（RAPD）[9]、简单序列重复区间扩增多态性（ISSR）[10]、扩增片段长度多态性 （AFLP）[11-12]、特征片段扩增区域 （SCAR）[13]、核糖体DNA（rDNA-ITS）[14-15]，其中核糖体 DNA（rDNA-ITS）是最常用的方法。核糖体 DNA（rDNA）中既包含保守的编码区18S、5.8S和28S，适合种以下水平的研究[16]；同时又包含进化速率较快的非编码区，内转录间隔区1和2（ITS1和ITS2）以及非转录区，承受的进化选择压力较小，进化速度较快，适合属以下水平的研究[17]。

内蒙古自治区东西地域跨度较大，地势复杂、气候多样，因此野生食用菌资源较丰富、差异性大、特异性强。这就需要食用菌科研工作者加大力度进行考察、收集、保育，充分挖掘内蒙古大草原上的珍稀野生食用菌资源。鄂尔多斯位于内蒙古自治区阿拉善-鄂尔多斯生物多样性中心的核心区域，是生物多样性研究的关键地带[18]。笔者团队于2017年8月在对鄂尔多斯市野生食用菌资源考察时采集到一株野生食用菌样品，当地百姓称之为“紫蘑菇”，且已有很长的食用历史。通过组织分离及收集孢子的方式获得纯菌丝体，进行驯化保育，并采用传统形态学分类及分子生物学方法对样品进行系统的分析鉴定。

1 材料与方法

1.1 供试样品

样品编号 gf7821，于2017年8月采自内蒙自治区西部鄂尔多斯市。样品被带回内蒙古农牧业科学院进行孢子收集，并通过组织分离方式获得纯菌丝体，后进行了保藏、驯化。

主要试剂：植物基因DNA提取试剂盒（离心柱型），天根生化科技 (北京)有限公司；PCR引物ITS1/4，上海生工生物工程有限公司。

主要仪器：QS510C高压灭菌锅，重庆雅马拓科技有限公司；SW-CJ-1F超净工作台，苏州安泰空气科技有限公司；5430R高速离心机，德国艾本德公司（eppendorf）；TC-EA48DAPCR仪，杭州博日科技有限公司；DYY-6C电泳仪，北京市六一生物科技有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 样品采集

采集样品后对其生态环境及外部形态进行现场观察，并详细记录，同时拍照。将样品清理干净，编号后带回内蒙古农牧业科学院。

1.2.2 孢子收集

将样品菌柄用小刀削去泥土，放入超净工作台，用75%的酒精擦拭菇体表面进行消毒；再将菇体表面用无菌水快速冲洗3次，用灭过菌的吸水纸尽量吸干菇体表面水分；然后用灼烧过的铁丝穿过菇体，菌褶向下悬挂于灭过菌的广口瓶内收集担孢子，于-70℃冰箱保存[19]。

1.2.3 母种及原种培养基

母种改良PDA培养基制作方法：马铃薯200 g·L-1、蔗糖 10 g·L-1、葡萄糖 10 g·L-1、酵母粉 1.5 g·L-1、蛋白胨 1.5 g·L-1、硫酸镁 0.5 g·L-1、磷酸氢二钾1 g·L-1、琼脂10 g·L-1加蒸馏水定容至1 L。于高压灭菌锅121℃灭菌25 min后备用。

原种燕麦培养基制作方法：新鲜无霉变的燕麦粒用自来水清洗干净，以料液比1.0∶1.6比例浸泡12 h，于高压灭菌锅121℃灭菌60 min后备用。

1.2.4 rDNA-ITS方法分子鉴定

1）DNA提取

子实体提取：将供试子实体置于65℃烘干箱内8 h烘干，然后置于微量植物样品粉碎机内粉碎，分装于离心管内，低温处保藏以备DNA提取。称取适量子实体粉末，用天根试剂盒提取DNA。

菌丝体DNA提取：刮取适量母种改良PDA培养基上的菌丝，置于液氮中研磨后用试剂盒提取DNA。

2）PCR扩增

ITS序列通用引物ITS1/ITS4，碱基序列如下。

ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。

PCR扩增采用20 μL反应体系：Mix 10 μL、引物各 1 μL、DNA 模板 2 μL、dd H2O 6 μL。

PCR反应程序：94℃预变性3 min；94℃变性40 s，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，30个循环；72℃继续延伸10 min；4℃保存。

电泳条件为：1.2%琼脂糖凝胶，电压100 V。

经过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，检测合格送往英潍捷基（上海）贸易有限公司测序。

3）序列比对、序列的数据分析及系统进化分析

将测序结果在NCBI中进行BLAST比对，根据比对序列结果及形态特征，进行同源性分析，并用DNAman 8验证，确定相关信息。从GenBank随机下载蘑菇科 （Agaricaceae）伞菌属 （Agaricus）的种序列用于系统发育分析，利用MEGA 6.0软件邻接法 NJ（Neighbor-joining method，NJ）构建系统进化树，以自展法（Bootstrap 1 000次重复）检验各分支的置信度。

2 结果与分析

2.1 生境

样品采集地位于鄂尔多斯市乌审旗（108°17′36″E～109°40′22″E，37°38′54″N～39°23′50″N）。该地地处毛乌素沙漠腹部，海拔为1 300 m～1 400 m，年平均气温6.8℃，全年日照2 800 h～3 000 h，有效积温2 800℃～3 000℃，年降水量350 mm～400 mm，年蒸发量2 200 mm～2 800 mm。

2.2 形态描述

样品子实体形态见图1。

图1 子实体外观形态Fig.1 Appearance of the fruit body

如图1所示，样品子实体小型，为浅褐色，遇伤后变红逐渐变紫，肉厚，有特殊的蘑菇香味；菌盖呈不规则形状、有少量浅褐色鳞片，菌盖直径3 cm ～7 cm，菌柄 （3～8）cm×（3～4）cm，圆柱或圆锥形；菌褶初期浅褐色，后渐变深褐色至黑色；菌柄上无菌环。子实体幼时主要生长在土壤里，成熟时依旧半生或全部在土壤里。

2.3 菌丝体培养及原基形成

通过组织分离方法，将菌种块移至改良的PDA平板培养基上，25℃下避光培养。试验结果见图2、图3。

图2 菌丝体发育成“小蘑菇”Fig.2 Mycelium develops into‘small fruit body’

图3 菌丝体发育成“蘑菇圈”Fig.3 The mycelium develops into a‘mushroom circle’

如图2、图3所示，一段时间后发现菌丝体长成多个块状的凸起，并不断长大，从外观上看类似于原基，直至长成一个“小蘑菇”，有的甚至形成类似于“蘑菇圈”的形态。将“小蘑菇”用解剖刀切开，见图4。

图4 “小蘑菇”解剖横面图Fig.4 Anatomical cross section of‘little mushroom’

如图4所示，为蘑菇形状的解剖横面图。再将母种转接至燕麦粒原种培养基中，在25℃下避光培养，见图5。

图5 燕麦二级培养基菌种Fig.5 Secondary strain in oat medium

如图5所示，可得到菌丝洁白、浓密、粗壮的二级原种。

2.4 系统发生学分析

经测定，样品子实体的rDNA ITS序列长度为950 bp。于2020年6月11日将测序结果通过NCBI进行BLAST比对，取其中最大评分和同源性较高的8个序列比对结果见表1。

如表1所示，样品gf7821与Agaricus padanus同源性最高，为98.33%～98.20%。将二者再次进行比对验证，在GenBank数据库中下载A.padanus的ITS序列，用DNAman 8软件进行序列比对，结果见图6。

图6 序列比对部分图Fig.6 Diagramof sequence alignment

由图6可知，序列一致度（identity）为68.18%，进一步说明分子水平上可确定gf7821为蘑菇科一个新的种。

从GenBank中随机下载蘑菇科伞菌属的种的序列，软件生成的系统进化树，见图7。

从图7中可以看出，样品gf7821与A.padanus聚为一类，且在外围，自展支持率为100%；而样品gf7821与Agaricus amicosus自展支持率为42%，与其他的序列则均不在同一类群上，遗传距离更远。由此分析可能样品gf7821与A.padanus可能在进化史、生活史上存在一定的关联，而与A.padanus及其他种可能有区域性差异或是生理生化特点上本质差异。

图7 基于ITS序列的系统发育进化树Fig.7 Bootstrap tree based on ITS sequences

3 结论与讨论

样品gf7821采集于气候干燥、毛乌素沙漠腹部的内蒙古西部鄂尔多斯市，独特的气候环境下生长的样品gf7821有其独一无二的特点。样品gf7821因其独特的味道深受当地人喜爱，但也因此遭到当地人过度采食而濒临灭绝，因此，应该受到重视，以保护这一珍贵的资源。

gf7821在母种阶段形成独特的原基结构“小蘑菇”，由于其独特的生长方式，可以考虑其出菇方式及形式是否也存在特异性，这是接下来工作需要突破的方向；形成类似的“蘑菇圈”是否与草原蘑菇也有相似的生活史及相同的生理生化特点也是值得深思的。通过形态学描述及分子标记法最终确定gf7821为蘑菇科的一个新种，结论具有可靠性。通过构建系统进化树，gf7821与A.padanus为同一类群可能在进化史、生活史上存在一定的关联。A.padanus首次记录于意大利，在中国境内首次记录于2012年新疆的艾比湖附近[20]，可参考A.padanus一些相关报道对gf7821进行人工驯化及生理生化特点分析，但必须考虑自身特点。

由于蘑菇科伞菌属真菌不仅味道鲜美，且在食（药）用方面占有重要地位，因此推断该种gd7821具有一定的开发价值，需进一步研究和探讨，为人工驯化提供可靠依据。