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分泌型卷曲相关蛋白1通过MAPK/ERK信号通路抑制结直肠癌细胞的迁移侵袭

2022-04-04雷建卫汪媛贺利荣

安徽医药 2022年4期
关键词:卷曲激酶试剂盒

雷建卫,汪媛,贺利荣

结直肠癌(CRC)是全球第三大最常见的癌症类型[1]。尽管其发病率一直在稳步下降,其部分原因是诊断和治疗方案的改善及社会风险因素暴露的减少,但结直肠癌的5 年预后生存率仍令人不甚满意[2-3]。分泌型卷曲相关蛋白1(SFRP1)是一种Wnt/β-连环蛋白(Wnt/β-catenin)信号通路抑制剂,其在抗癌药的开发中具有重要作用[4]。SFRP1 被认为是一种WNT信号的抑制剂,其在许多肿瘤中表现出异常失调[5-7]。这说明SFRP1 的异常表达可能是WNT信号通路在肿瘤发生过程中被激活的重要机制。该基因在结直肠癌中虽已有研究报道,但其调控结直肠癌细胞迁移和侵袭的机制尚未十分清楚。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路在结直肠癌进展中的重要作用已得到许多研究的认可,但是其与SFRP1 基因之间的关系尚未明白。本研究起止时间2018 年11 月至2019年6月。本研究旨在探索SFRP1与MAPK/ERK 信号通路在结直肠癌进展中的关系。

1 材料与方法

1.1 材料正常结肠上皮细胞HCoEpiC、人结直肠癌细胞HCT8、SW480、RKO 购自ATCC;DMEM 培养基购自美国Selleck 公司;LipofectamineTM2000 购自北京宜科思源公司;BCA 蛋白定量试剂盒、反转录试剂盒均购自碧云天公司;PVDF 膜购自德国罗氏诊断有限公司;RIPA 蛋白裂解液购自Invent 公司;Transwell小室购自美国Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将正常结肠上皮细胞HCoEpiC、人结直肠癌细胞HCT8、SW480、RKO 用含10%胎牛血清的DMEM培养基,置于37 ℃,5%二氧化碳的恒温培养箱中常规培养,待细胞生长至融合度75%左右,用胰蛋白酶消化约1 min,按照1∶3 的比例更换培养基,每2天传代一次。

1.2.2 细胞转染与分组 将正常培养的HCT8 细胞随机分成pcDNA 3.1 组(转染pcDNA 3.1)、pcDNA 3.1-SFRP1 组(转染pcDNA 3.1-SFRP1)、pcDNA 3.1-SFRP1+DMSO 组(共 转 染pcDNA 3.1-SFRP1 和DMSO)、pcDNA 3.1-SFRP1+IGF1 组(共转染pcDNA 3.1-SFRP1 和IGF1),按照LipofectamineTM2000 转染试剂盒说明书操作,转染至HCT8 细胞。用qRTPCR法检测转染效率,转染成功后用于后续试验。

1.2.3 qRT-PCR 法检测细胞中SFRP1 的mRNA 表达 取适量细胞,用RNA 抽提试剂盒提取总RNA,然后用逆转录试剂盒合成cDNA。最后按qRT-PCR试剂盒说明书操作进行SFRP1 检测。以GAPDH 为内参,2-ΔΔCt计算SFRP1 的表达。ΔΔCt=[(CTCTSFRP1-CTGAPDH)Treatmentgroup-(CTCTSFRP1-CTGAPDH)Controlgroup]。每个样本做3 个复孔,实验重复3 次。引物信息(5'-3'):SFRP1 正向引物TGACTTCAGGTCAAGGGATGGT,反向引物ACATCGCTTGAGGATCTGGAA;GAPDHF正向引物TGGGTGTGAACCATGAGAAGT,反向引物TGAGTCCTTCCACGATACCAA。

1.2.4 Western blotting 检测细胞中的蛋白表达 检测SFRP1、波形蛋白(Vimentin)、纤维黏连蛋白(FN)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、上皮钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、MAPK/ERK信号通路关键基因(Ras)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)、磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(p-ERK1/2)、细胞外信号调节激酶(ERK)的蛋白表达。

收集细胞,用裂解液充分裂解,提取总蛋白,进行BCA 法定量,再用沸水浴变性处理10 min。取上清进行上样,蛋白电泳。电泳结束后用转膜仪将蛋白湿转移至PVDF 膜;5%脱脂奶粉将膜封闭2 h,洗膜,加入Ⅰ抗,4 ℃过夜孵育,洗膜,加Ⅱ抗,4 ℃2 h。加发光液,曝光。用Quantity One 软件处理条带的灰度值,目的条带灰度值与内参GAPDH 灰度值的比值表示目的蛋白的表达情况。

1.2.5 Transwell 小室检测细胞的迁移和侵袭 将Transwell 小室置于孔上,放入细胞培养箱平衡30 min。然后将各组细胞消化,用纯RPMI 1640培养基配制成5×105个/毫升的细胞悬液。每个小室加入200 μL 细胞悬液,即每孔细胞约为1×105个。每组设置3个复孔,将24孔板放入37 ℃、5%二氧化碳培养箱中培养24 h 后,取出上腔,用棉签擦去上室膜上未迁移的细胞,PBS 洗2 次,甲醇固定30 min。自然晾干后,用1 g/L 结晶紫染液染色20 min。弃染液,双蒸水洗2 次。取出后于倒置显微镜下观察拍照(400倍),计数上、下、左、右、中5个不同视野的总细胞数取平均值。

将转染成功的对数期细胞进行Transwell 侵袭实验。将基质胶和RPMI 1640 培养基按1∶8 稀释后(60 μL)铺于培养小室上,风干后备用,其他步骤同Transwell体外迁移实验。

1.3 统计学方法实验中所有数据均采用SPSS 21.0 软件进行分析,使用GraphPad Prism 6.0 进行相关图片的绘制。计量资料用表示,两组比较采用独立样本t检验,多组间数据比较采用单因素方差分析,用LSD-t法进行两组间的比较,P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SFRP1 在结直肠癌细胞中的表达与HCoEpiC相比,HCT8、SW480、RKO细胞中SFRP1 mRNA和SFRP1 蛋白表达均显著降低(P<0.05)。其中HCT8对SFRP1 的变化差异最显著,故选用该细胞用于后续实验。见图1、表1。

表1 SFRP1在结直肠癌细胞中的表达/

表1 SFRP1在结直肠癌细胞中的表达/

注:SFRP1 为分泌型卷曲相关蛋白1,HCoEpiC 为正常结肠上皮细胞,HCT8、SW480、RKO均为人结直肠癌细胞。①与HCoEpiC比较,P<0.05。

图1 SFRP1蛋白在结直肠癌细胞中的表达

2.2 过表达SFRP1 对结直肠癌细胞迁移、侵袭的影响与pcDNA 3.1组相比,pcDNA 3.1-SFRP1组细胞中SFRP1mRNA 表达显著升高,迁移细胞数和侵袭细胞数均显著降低(P<0.05)。见图2、表2。

表2 过表达SFRP1对结直肠癌细胞迁移、侵袭的影响/

表2 过表达SFRP1对结直肠癌细胞迁移、侵袭的影响/

注:pcDNA 3.1为转染pcDNA 3.1,pcDNA 3.1-SFRP1为转染pcDNA 3.1-SFRP1,SFRP1为分泌型卷曲相关蛋白1。

2.3 过表达SFRP1 对结直肠癌细胞迁移侵袭相关蛋白表达的影响与pcDNA 3.1 组相比,pcDNA3.1-SFRP1 组细胞中SFRP1 mRNA 表达显著升高,Vimentin、FN、MMP-9、N-cadherin的蛋白表达量均显著降低,SFRP1、E-cadherin 的蛋白表达量显著升高(P<0.05)。见图3、表3。

图3 过表达分泌型卷曲相关蛋白1(SFRP1)对结直肠癌细胞迁移侵袭相关蛋白表达的影响

表3 过表达SFRP1对结直肠癌细胞迁移侵袭相关蛋白表达的影响/

表3 过表达SFRP1对结直肠癌细胞迁移侵袭相关蛋白表达的影响/

注:pcDNA 3.1 为转染pcDNA 3.1,pcDNA 3.1-SFRP1 为转染pcDNA 3.1-SFRP1,SFRP1 为分泌型卷曲相关蛋白1,Vimentin 为波形蛋白,FN为纤维黏连蛋白,MMP-9为基质金属蛋白酶9,E-cadherin为上皮钙黏蛋白,N-cadherin为N-钙黏蛋白。

2.4 过表达SFRP1 抑制MAPK/ERK 信号通路的活性与pcDNA 3.1组相比,pcDNA 3.1-SFRP1组细胞中Ras、mTOR、ERK1/2、p-ERK1/2、ERK 的蛋白表达显著降低(P<0.05)。见图4、表4。

表4 过表达SFRP1对MAPK/ERK信号通路活性的影响/

表4 过表达SFRP1对MAPK/ERK信号通路活性的影响/

注:pcDNA 3.1 为转染pcDNA 3.1,pcDNA 3.1-SFRP1 为转染pcDNA 3.1-SFRP1,SFRP1 为分泌型卷曲相关蛋白1,Ras 为丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(MAPK/ERK)信号通路关键基因,mTOR 为雷帕霉素靶蛋白,ERK1/2 为细胞外信号调节激酶1/2,p-ERK1/2 为磷酸化细胞外信号调节激酶1/2,ERK为细胞外信号调节激酶。

图4 过表达分泌型卷曲相关蛋白1(SFRP1)的HCT8细胞中丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(MAPK/ERK)信号通路相关蛋白的表达

2.5 激活MAPK/ERK信号通路对SFRP1抑制结直肠癌细胞迁移侵袭的影响与pcDNA 3.1-SFRP1+DMSO组相比,pcDNA3.1-SFRP1+IGF1组细胞中SFRP1 mRNA的表达显著降低,迁移细胞数和侵袭细胞数均显著升高,Vimentin、FN、MMP-9、N-cadherin的蛋白表达量均显著升高,SFRP1、E-cadherin的蛋白表达量显著降低(P<0.05)。见图5、图6、表5。

表5 激活丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(MAPK/ERK)信号通路对SFRP1抑制结直肠癌细胞迁移侵袭的影响/

表5 激活丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(MAPK/ERK)信号通路对SFRP1抑制结直肠癌细胞迁移侵袭的影响/

注:pcDNA 3.1-SFRP1为转染pcDNA 3.1-SFRP1,pcDNA 3.1-SFRP1+DMSO 为共转染pcDNA 3.1-SFRP1和DMSO,pcDNA 3.1-SFRP1+IGF为共转染pcDNA 3.1-SFRP1 和IGF,SFRP1 为分泌型卷曲相关蛋白1,Vimentin 为波形蛋白;FN 为纤维黏连蛋白,MMP-9 为基质金属蛋白酶9,Ecadherin为上皮钙黏蛋白,N-cadherin为N-钙黏蛋白。①与pc DNA 3.1-SFRP1+DMSO组比较,P<0.05。

图6 结直肠癌细胞迁移侵袭相关蛋白的表达

3 讨论

SFRP1 位于8p12-11.1 号染色体,是WNT 信号通路的负调控因子之一,其被转录为35-kDa糖蛋白[8]。SFRP1 由两个富含半胱氨酸的结构域组成,这两个结构域称为netrin 和CRD,它们与卷曲受体有关[9]。SFRP1 由于没有跨膜结构域而被释放到细胞外空间,可以通过与卷曲蛋白竞争性结合而阻断WNT信号通路的激活[10]。Vimentin、FN、MMP-9、N-cadherin、E-cadherin这些均为上皮细胞发生间质化转移的重要参与基因,与细胞的迁移和侵袭能力紧密相关,也与细胞中Wnt-βcatenin信号通路的活性相关[11-12]。

据报道,SFRP1的表达在多种人类癌症类型中都下调[13]。吴琼等[14]在结直肠癌的研究中报道,5-氮杂-2'-脱氧胞苷可抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭,并上调SFRP1,进而抑制Wnt/β-catenin 信号通路和上皮间质化。由此推测,SFRP1的上调可能也可抑制结直肠癌细胞的迁移和侵袭。本研究通过qRT-PCR、Western blotting 检测了结直肠癌细胞中SFRP1 的表达,发现SFRP1在结直肠癌细胞中异常下调表达,这与前人关于SFRP1在各种肿瘤中的表达水平是相一致的;进一步研究发现,过表达SFRP1可抑制结直肠癌细胞的迁移和侵袭,并下调Vimentin、FN、MMP-9、N-cadherin的表达,上调E-cadherin的表达,这说明SFRP1可直接抑制结直肠癌细胞的迁移和侵袭,产生这种作用的机制与下调Vimentin、FN、MMP-9、N-cadherin 的表达,上调E-cadherin的表达具有相关性;深入研究发现,SFRP1 可抑制MAPK/ERK 信号通路的活性,推测SFRP1的功能除了与WNT信号通路的活性有关外,还可能与MAPK/ERK信号通路有关。

丝裂原激活蛋白激酶(mitogen activated proteinkinase,MAPK)信号通路由四个不同的级联通路相联系,包括细胞外信号相关激酶(ERK1/2)、Jun氨基末端激酶(JNK1/2/3)、p38-MAPK 和ERK5[15]。据报道,MAPK/ERK 通路与细胞增殖、分化、迁移和凋亡有关[16]。MAPK/ERK信号通路关键基因包括Ras、mTOR、ERK1/2、p-ERK1/2、ERK 等[17]。Han 等[18]在结直肠癌的研究中发现,MAPK/ERK信号通路在结直肠癌中可被原癌基因B淋巴细胞白血病前体蛋白转录因子3抗体(PBX3)异常激活,进而有益于PBX3的促癌功能。Dahlmann等[19]报道,晚期糖基化终产物(RAGE)与结直肠癌转移的预后生物标志物S100A4相互作用,可直接导致过度活化的MAPK/ERK信号通路失活,进而参与结直肠癌的迁移、侵袭调控。本研究结果显示,过表达SFRP1可抑制MAPK/ERK信号通路的活性,深入研究发现,激活MAPK/ERK信号通路可逆转SFRP1对结直肠癌细胞迁移侵袭的抑制作用,这说明该通路参与SFRP1在结直肠癌中的功能。

综上所述,过表达SFRP1 可抑制结直肠癌细胞的迁移和侵袭,其机制与抑制MAPK/ERK 信号通路的活性有关,为结直肠癌的治疗提供参考。

(本文图2,5见封三)

图2 过表达SFRP1对结直肠癌细胞迁移、侵袭的影响

图5 激活MAPK/ERK信号通路对结直肠癌细胞迁移侵袭的影响

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