超声引导下细针穿刺细胞病理学联合CK19、TPO检测对TI-RADS 4a和4b类甲状腺结节的诊断价值

詹小林，周燕，曹艳芸，高红燕，刘杰

甲状腺影像报告和数据系统（TI-RADS）4a和4b类结节属于低、中度可疑恶性结节（根据Kwak 提出的TI-RADS 分类标准），恶性率分别为3.6%～12.7%及6.8%～37.8%［1-3］。若选择外科手术，良性结节病人将承受身体和心理双重负担，造成经济和医疗资源浪费。若不选择手术治疗，有可能延误甲状腺癌的治疗时机，给病人造成严重的精神压力，降低生活质量。因此，术前准确判断TI-RADS 4a和4b类结节的良恶性具有重大医疗价值和社会意义。近年来，超声引导下细针穿刺活检（US-FNA）从细胞学角度显著提高甲状腺结节术前良恶性判断的准确率［4-7］，但尚存在一定缺陷。细胞角蛋白19（CK19）是在甲状腺癌中呈高表达，是一种新型肿瘤标志物［8-9］。甲状腺过氧化物酶（TPO）在恶性肿瘤中的合成受到不同程度的抑制［10-12］。CK19和TPO表达率均对甲状腺结节的良恶性判断具有重要意义。本研究通过对比术前US-FNA、CK19、TPO 和三者联合对TI-RADS 4a和4b类结节的诊断效能，探索三者联合检测对提高此类结节良恶性诊断准确度的临床价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2020 年3 月至2021 年9 月在安徽医科大学第四附属医院超声科检查的甲状腺疾病137 例，共计148 个结节。年龄范围21～82 岁，年龄（37.2±17.8）岁，男女比例约1∶2.43。TI-RADS 4a 类结节95 个，4b类结节53 个；结节长径范围4.20～39.00 mm，大小约（12.71±3.53）mm；右侧79 个（53.38%），左侧叶63 个（42.57%），峡 部6 个（4.54%）。纳入标准：①术前通过常规超声评估为TI-RADS 4a和4b类甲状腺结节；②接受超声引导下细针穿刺；③进行CK19 和TPO 两种抗体免疫组织化学检测；④所有甲状腺结节最后经手术病理证实。排除标准：①不能耐受麻醉或手术者；②凝血功能障碍者；③不能配合介入穿刺者。本研究经病人及其近亲属知情同意，并签署知情同意书，本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 TI-RADS 分类应用阿洛卡ARIETTA 60 型超声诊断仪，探头型号L441（频率5～10 MHz）。确定甲状腺结节位置、大小、数目、纵横比、边缘、回声、边缘、钙化和血流分布，及周边淋巴结的形状和血流灌注情况。恶性结节的五项超声征象：边界不清、极低回声、微钙化、纵横比大于1 和异常肿大淋巴结。根据Kwak 等［2］提出TI-RADS 分类标准：具有一项恶性征象的结节评定为TI-RADS4a 类，具有两项恶性征象的结节评定为TI-RADS 4b 类。按纳排标准选取TI-RADS 4a和4b类结节，以备后续研究。

1.3 US-FNA 仪器和探头选择与前相同，查看血常规及凝血常规报告，充分告知操作的风险和注意事项，签署知情同意书。操作流程：①依据结节位置确定穿刺点，设计穿刺路径；②病人采仰卧位，充分暴露颈部，常规消毒铺洞巾；③助手医生使用探头实时监控，操作者戴无菌手套持22 G 穿刺针穿刺进入甲状腺结节中心时停止进针，拔出针芯，沿不同方向来回提插4～5次，迅速拔针，回抽预备的5 mL 注射器，使注射器内充满空气，套上穿刺针，针头斜面向下对准载玻片，快速推动活塞，将吸取物推射到玻片的一端，使用另一块玻璃片将标本均匀涂抹开涂片，立即使用95%乙醇固定送病理科行细胞学分级诊断检查。④涂片后将穿刺针反复抽吸及推出细胞穿刺保存液2 次送免疫组化检测；⑤穿刺完毕，贴干净敷料，加压止血观察20～30 min。细胞学结果参照甲状腺细胞病理学Bethesda 报告系统［13］推荐的分类标准进行分类诊断。

1.4 CK19 和TPO 检测对所有甲状腺FNA 标本进行细胞沉渣包埋制作成细胞蜡块，再进行CK19、TPO 免疫组化检测，进一步分析甲状腺结节的良恶性。主要试剂：细胞学穿刺保存液购自安必平（中国）公司；CK19、TPO 抗体分别购自迈新和安必平公司，二抗和显色试剂盒购自迈新公司，免疫组化采用MaxiVision 两步法进行检测，结果由本院两位病理科医师结合细胞学涂片与细胞蜡块CK19 和TPO免疫组化染色综合判断结节良、恶性。

1.5 结果判读US-FNA能明确良恶性质的结节，以US-FNA为标准，CK19和TPO作为参考。US-FNA不能明确良恶性质的结节，以US-FNA、CK19和TPO联合判断：US-FNAC以细胞病理学Bethesda分类≥Ⅳ类提示恶性，CK19表达阳性提示恶性，TPO表达阴性提示恶性。以上三者中，任意两项或两项以上提示恶性时，诊断为恶性结节；反之，诊断为良性结节。

1.6 统计学方法采用SPSS 21.0 统计软件进行分析，病例数以例表示，计数资料以例（%）表示。CK19和TPO在良、恶性结节中的表达率比较采用χ2检验。以术后病理结果为金标准，分别计算USFNA、CK19、TPO 及三者联合诊断TI-RADS 4a 和4b类结节良恶性的敏感度、特异度、准确度、阳性预测值和阴性预测值。绘制ROC 曲线，采用正态性Z检验，比较四种方法的曲线下面积（AUC）。P＜0.01 认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 手术病理共纳入研究的148 个TI-RADS 4a和4b 类结节。乳头状癌44 个（44/148，29.73%），其中4a 类结节23 个（23/95，24.21%），4b 类结节21 个（21/53，39.62%）。良性结节104 个（104/148，70.27%）。良性结节中，结节性甲状腺肿57 个（57/104，54.81%），桥本甲状腺炎35 个（35/104，33.65%），甲状腺腺瘤7 个（7/104，6.73%），亚急性甲状腺炎5个（5/104，4.81%）。

2.2 US-FNA 细胞病理学分类148 例TI-RADS 4a和4b类结节中，Bethesda 细胞病理学分类Ⅱ类结节占比最多（59 例，59/148，39.86%），Ⅳ类次之（32 例，32/148，21.62%），Ⅰ类最少（7例，7/148，4.73%），见表1。

表1 TI-RADS 4a和4b类结节US-FNA细胞病理学Bethesda 分类

2.3 CK19和TPO的表达如表2所示，CK19（+）在恶性结节的表达率为86.36%（38/44），而在良性结节的表达率仅为13.46%（14/104），即CK19在恶性结节中的阳性表达率高于良性结节（P＜0.01），见图1。

图1 CK19（＋）甲状腺乳头状癌（免疫组化染色法×400）

表2 CK19和TPO在甲状腺TI-RADS 4a和4b类结节中的表达/例（%）

TPO（-）在恶性结节的表达率为77.27%（34/44），良性结节中的表达率为15.38%（16/104），即TPO（-）在恶性结节中的表达率高于良性结节（P＜0.01），见图2。

图2 TPO（－）甲状腺乳头状癌（免疫组化染色法×400）

2.4 US-FNA、CK19、TPO 及三者联合检查对TIRADS 4a 和4b 类结节的诊断效能US-FNA、CK19和TPO 单独用于判断TI-RADS 4a 和4b 类结节的良恶性时，其灵敏度、特异度、准确度、阳性预测值和阴性预测值均低于三者联合检查，见表3。

表3 US-FNA、CK19、TPO及三者联合诊断TI-RADS 4a和4b类结节良恶性的AUC

US-FNA、CK19、TPO 诊断TI-RADS 4a 类结节良恶性的AUC 分别为0.839、0.882 和0.860，均小于三者联合检查的0.944，差异有统计学意义（P＜0.01）。见图3、表4。

表4 US-FNA、CK19、TPO及三者联合检查对TI-RADS 4a和4b类结节良恶性的诊断效能/%（n/N）

图3 US-FNA、CK19、TPO诊断TI-RADS 4a和4b类结节良恶性的ROC曲线

3 讨论

甲状腺的良恶性结节在超声图像上存在着一定的重叠性，常表现同病异影，异病同影［14］；所以甲状腺结节的良恶性鉴别一直是临床诊治甲状腺疾病的难点，其中TI-RADS 4a和4b类结节处于良恶性之间的过渡区域，恶性风险具有较大的不确定性，故有必要应对TI-RADS 4a和4b类结节做评估研究。本研究为临床深入认识TI-RADS4a 和4b 类结节提供了理论依据，为进一步提高此类结节的术前良恶性鉴别准确度提供了方法学依据。

US-FNA 利用细针抽吸对甲状腺结节进行穿刺，获取结节的细胞成分，通过分析镜下细胞学病理学对结节良恶性进行判断，是目前诊断TI-RADS4类结节甲状腺结节良恶性的常用方法。文献数据表明，US-FNA 在诊断甲状腺结节良恶性的灵敏度65%～98%，特异度72%～100%，准确度80%～95%［15］。根据2007 年发布的细胞病理学Bethesda 系统，本研究实现对148 个TI-RADS 4a 类和4b 类结节进行细胞学诊断。本研究中US-FNA 单独诊断TI-RADS 4a类和4b类结节的良恶性的灵敏度、特异度和准确度分别为84.09%、83.65%和87.16%。这与既往文献报道数据一致。既往文献表明，US-FNA 细胞学病理诊断对15%～30%甲状腺结节无法明确性质［16-18］。本研究中该比例约34%，尚需要结合CK19 和TPO检测。

CK19是一种低分子量细胞角蛋白，在各种上皮组织和肿瘤中表达。研究发现，CK19甲状腺乳头状癌中呈弥漫性表达，而在良性结节中仅表达为局部弱阳性。因此，CK19可以作为甲状腺癌的辅助诊断指标。郭宏义等［19］的研究中CK19 在恶性结节中的阳性表达率为93.82%，Viana AOR 等［20］的研究结果CK19 在乳头状癌中的阳性率为80%。本研究中25个恶性结节中，CK19 呈阳性表达的结节为22 个，表达率为88.00%。与既往研究基本一致。需要指出的是，Viana AOR 等［20］的研究结果显示CK19 在滤泡样肿瘤中的阳性表达率较低，仅为57%。而本研究中未检测到滤泡样肿瘤，尚需大样本进一步探索。

TPO是合成甲状腺激素所需的膜结合蛋白，被认为是甲状腺分化标志物，在甲状腺恶性结节中表达率减低，良性结节中表达率较高。既往研究结果表明TPO阴性诊断甲状腺恶性结节的灵敏度、特异度和准确度分别为88.2%、77.8%和86.0%［19］。与该研究结果相似，本研究95个TI-RADS 4a类及53个TI-RADS 4b类结节中，TPO阴性表达诊断甲状腺癌的灵敏度、特异度和准确度分别为86.36%、85.58%和85.81%。据此，TPO可作为鉴别甲状腺结节良恶性的重要标志物。

需要说明的是，本研究TI-RADS 4a 类结节中最终确诊恶性率为24.21%，高于KwakTI-RADS4a类结节恶性率为5%～10%。推测主要是由于我们判定结节是否为垂直位，要求结节前后径不仅大于左右径（横切面），还应大于上下径（纵切面），比单纯用前后径大于左右径，或前后径大于上下径，结节更倾向于恶性；第二，我们收集的结节较小，大部分在15 mm以下，对于结节边界及形态评判相对较难。另外，超声医学是一门高度依赖于经验的学科，结节危险度的评判个人经验不是很足。随着项目研究的深入开展，活检及术后结果随访，术前对结节TI-RADS分级的准确性可得到显著提高。4a和4b类结节按照FNA指南，本研究FNA 有所放宽，主要有以下几个原因：第一，因为部分结节紧邻被膜、气管、喉返神经或食管；第二，部分是因为病人发现结节后精神高度紧张，强烈要求FNA；第三，部分是外科医生或内分泌科医生建议病人FNA，特别是两侧叶多发结节，外科医生想明确结节性质确定手术切除范围。

鉴于US-FNA 对Bethesda Ⅲ类和Ⅳ类尚无法明确其性质，CK19和TPO在良恶性结节中的表达也有部分交叉，三者单独用于诊断TI-RADS 4a和4b类结节的良恶性均有一定程度缺陷。本研究通过对比发现，US-FNA、CK19 和TPO 三者联合诊断的灵敏度、特异度、准确度、阳性预测值、阴性预测值和AUC分别为95.45%、93.27%、93.93%、85.71%、97.98%和0.944，诊断效能高于单独采用三者。另外，同时细胞学及分子检测，可较快地、准确地反馈诊断结果，对指导临床制定进一步治疗措施，减轻病人焦虑具有重要作用。

综上所述，US-FNA 联合CK19、TPO 检测有助于提高甲状腺TI-RADS4a 和4b 类结节良恶性鉴别的灵敏度、特异度和准确度，进而有助于临床医生和病人选择最佳的治疗策略。