阿司匹林抵抗和缺血性脑卒中的相关性研究

李植灿，姚庆阳，王灿明，黄清宇

福建省泉州市第一医院神经内科，福建泉州 362000

缺血性脑卒中在中老年人群中是一种发病率较高的脑血管疾病[1]。该病发作突然，病情进展快速，如不及时治疗，可引起患者残疾或死亡。目前临床上主要通过抗血小板药物对该病进行治疗，可有效控制缺血性脑卒中患者的病情进展。阿司匹林是一种常用的抗血小板药物，但近些年来随着该药物的广泛的应用，有调查研究发现，部分患者服用阿司匹林后无法有效降低缺血性脑卒中复发风险，同时指出这可能与阿司匹林抵抗（aspirin resistance, AR）现象有关[2]。近些年来随着基因技术的发展进步，有研究发现，阿司匹林是一种非选择性环氧合酶（cyclooxygenase, COX）抑制剂，能与COX进行反应使酶失去活性，从而对花生四烯酸（arachidonic acid, AA）进行有效抑制，使血小板在血栓素A2（thromboxaneA2, TXA2）介导下发生的聚集现象被阻断[3]。阿司匹林能不可逆地抑制COX-1 与COX-2，但对COX-1 具有更强的抑制效果，因此，其对COX-1 的抑制程度在很大程度上决定了其抗栓效果。近些年随着对COX 基因多态性研究的深入，有研究指出AR 现象可能与COX-1 受体上-1676A＞G 及COX-2 基因启动子区的-765G/C 多态性有关[4]。基于此，本文方便选取2018 年1 月—2020 年9 月在泉州市第一医院神经内科住院的258 例缺血性脑卒中患者为研究对象，对其AR 与缺血性脑卒中之间的相关性进行了研究分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

方便选取于本院神经内科住院的258 例缺血性脑卒中患者为研究对象，所有患者入院后均进行磁共振检查发现新的脑梗死病灶，并根据GUM标准：采用10 μmol/L 二磷酸腺苷（adenosine diphosphate, ADP）对血小板进行诱导，AS 为血小板聚集率＜70%，AR 为血小板聚集率≥70%。其中，AS 组170 例，AR 组88 例。阿司匹林敏感（Aspirin sensitivity, AS）组中男105 例，女65 例；年龄49～79 岁，平均（65.24±3.87）岁；体质指数（body mass index, BMI）19.89～32.14 kg/m2，平均（25.99±3.05）kg/m2；吸烟患者66 例，不吸烟患者104 例；高血压病患者104 例（61.18%）；糖尿病患者58 例（34.12%）。AR 组中男58 例，女30 例；年龄51～80 岁，平均（66.08±3.91）岁；BMI 20.13～32.89 kg/m2，平均（26.11±3.09）kg/m2；吸烟患者34 例，不吸烟患者54 例；高血压病患者55例（62.5%）；糖尿病患者24 例（27.27%）。两组患者基本临床资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究通过本院医学伦理委员会审批。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：①年龄49～80 岁者；②已签署知情同意书者；③病情稳定可控，精神状态良好，能够积极配合完成本次研究者。排除标准：①各种原因，中途要求自动退出者；②阿司匹林过敏者；③合并严重消化性溃疡、出血者；④合并急慢性血液系统疾病者；⑤合并重症高血压、房颤者；⑥合并严重肝肾功能不全者；⑦近期合并脑出血、脑外伤及手术者；⑧长期酗酒者。

1.3 方法

①光比浊法测定血小板集聚率：抽取全血放置在枸橼酸钠抗凝管中，用以 500 r/min 的离心机，离心 5 min，提取上层富含血小板的血浆（platelet rich plasma, PRP）。将剩余血液标本再次以3 000 r/min转速离心 15 min，提取上层贫血小板血浆（platelet poor plasma, PPP），用作实验校正。200 μl PRP 放置在样品方杯中，200 μlPPP 放置于校正方杯中，恒温预热3 min。仪器调至TEST 状态，进行仪器检测零点校正，待数值稳定后，往杯底加入10 μmol/L ADP 5μl，进行血小板聚集率测试。据GUM 标准：用10 μmol/L ADP 诱导的血小板聚集率≥70%定义为AR，血小板聚集率＜70%定义为阿司匹林敏感。

②DNA 提取：提取晨起空腹患者静脉血2 mL，放置保存在枸橼酸钠抗凝管中，用DNA 提取试剂盒提取全血中的DNA，并于-20℃环境下进行保存。

③聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）及DNA 测序：首先从把COX-1、COX-2 基因变异位点从HapMap 中国汉族人群数据库中提取出来。以0.05 为最小等位基因频率（minor allele frequency, MAF）下限，利用获取的变异位点以r2＞0.8原则对tag SNP 进行鉴别挑选。对COX-1 -1676A＞G 引物、COX-2 上765G/C 引物进行扩增处理。完成后对PCR 产物进行DNA 测序检测。

1.4 统计方法

采用SPSS 19.0 统计学软件处理数据，计数资料以频数和百分率（%）表示，采用χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。另使用Pearon Chi-Square 对基因型及表型进行检测，之后使用Hapviewer 软件对基因位点是否出现连锁不平衡现象进行计算。

2 结果

2.1 两组Hard-Weinberg 平衡检验

258 例患者血液DNA 检测结果显示，在COX-1 -1676A＞G 位点中，AA 纯合子、AG 杂合子、GG 突变 纯合 子 分 别 为90 例、131 例、37 例；在COX-2-765G/C 位点中，GG 纯合子、GC 杂合子分别为221例、37 例，CC 突变纯合子未发现。COX-1 -1676A＞G 及COX-2 -765G/C 等位基因频率分别符合Hard-Weinberg 平衡检验，样本有广泛代表性。见表1。

表1 所选位点的基因型频率分布及Hard-Weinberg 平衡检验Table 1 Genotype frequency distribution and Hard-Weinberg equilibrium test for selected loci

2.2 两 组 患 者COX-1 -1676A＞G 及COX-2-765G/C 位点基因型分布比较

AS 组与AR 组COX-1 -1676A＞G 位点G 等位基因携带及COX-2 -765G/C 位点C 等位基因携带相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 两组患者COX-1 -1676A＞G 及COX-2 -765G/C 位点基因型分布对比[n(%)]Table 2 Comparison of genotype distribution of COX-1 -1676A＞G and COX-2 -765G/C loci between the two groups of patients[n(%)]

2.3 两组患者终点事件发生率比较

两组258 例患者共出现42 例终点事件，占比16.28%。 其 中 死 亡3 例（1.16%），脑 出 血5 例（1.94%），心肌梗死3 例（1.16%），缺血性脑卒中复发31 例（12.02%）。其中，AR 组缺血性脑卒中复发率明显高于AS 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 两组终点事件发生率对比[n(%)]Table 3 Comparison of the incidence of end-point events between the two groups[n(%)]

2.4 两组患者临床预后与COX-1-1676A＞G、COX-2-765G/C 基因型相关性分析

COX-1-1676A＞G 其G 等位基因携带和缺血性脑卒中复发相比存在相关性（OR=0.28，95%CI=0.05～2.31，P＜0.05）；COX-2-765G/C 其C 等位基因携带与缺血性脑卒中复发均无相关性（OR=5.71，95%CI=1.11～29.55，P＞0.05）。见表4。

表4 两组患者临床预后与COX-1 -1676A＞G、COX-2 -765G/C基因型相关性分析Table 4 Correlation analysis between clinical prognosis and COX-1-1676A ＞G and COX-2-765g /C genotypes in the two groups

3 讨论

本研究结果显示：AR 组缺血性脑卒中复发率明显高于AS 组（P＜0.05），提示缺血性脑卒中复发与AR 存在密切联系。近些年来基因技术的重大突破，为临床相关方面的研究开辟了一条新途径，即从分子流行病学角度对心脑血管疾病与基因变异之间存在的联系进行研究，并且已有研究在某些方面已经证实AR 与遗传的基因易感性存在密切联系[5-6]。因此对人群中的AR 易感性基因进行筛查可指导和帮助临床上更好地识别和防治高危人群。AR 具有较为复杂的发病机制，且肥胖、吸烟等内外多种因素均会对其发生产生影响，其作用机制主要是通过对患者基线状态下血小板活性产生影响，从而对抗血小板治疗反应性进行影响。而本研究纳入的两组患者的临床基本资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），因此，在本研究中可以将基线状态下混杂因素对阿司匹林敏感性的干扰排除，所以本文主要对阿司匹林治疗效果与COX-1、COX-2 基因之间存在的关系进行研究分析。

目前国内外并无统一的标准来检测AR，主要有：血栓弹力图检测、电阻抗聚集度法测定、光比浊法测定、血小板功能分析仪、出血时间测定、血清TXA2 及其代谢物含量测定法、Verify Now 系统等[7]。但这些方法都各有利弊，在一定程度上会受到特异性和/或敏感性方面的固有的偏差影响。根据国内外的一些报告，不同的检测方法，其AR 的发生率在5%～60%之间[8]。本研究通过光比浊法测定发现AR 的发生率为34.1%。

本研究结果显示AR 组COX-1-1676A＞G 位点G 等位基因携带频率达71.59%，高于AS 组的61.76%，但两组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；对258 例患者进行随访发现脑梗死复发的患者中GA+GG 基因型频率达87.1%，未复发组达62.1%，且COX-1-1676A＞G 其G 等位基因携带和缺血性脑卒中复发之间存在相关性（OR=0.28，95%CI=0.05～2.31，P＜0.05）。这一研究结果与张萃艺等[9]的研究相一致，服用阿司匹林但仍发生脑缺血性事件的概率达到70.23%，与由于1676A＞G 基因突变型存在明显相关性（OR=0.26），并提出这可能是1676A＞G 携带的G 等位基因提高COX-1 RNA 的表达，增加蛋白质的合成，促进TXA2 的合成，促使血小板大量聚集形成血栓。根本原因是COX-1-1676A＞G 基因在中国汉族人群中比较常见，在我国心脑血管疾病患者中阿司匹林耐药性与COX-1 基因-1676A＞G 携带的G 等位基因变异体密切相关[10]。李虓等[11]通过调查431 例服用阿司匹林的老年汉族心脑血管疾病患者的COX-1 基因中单核苷酸多态性位点（single nucleotide polymorphisms, SNP）与AR 的关联性，发现COX-1 基因-1676A＞G 携带的G 等位基因可增加AR 的发病风险。但有研究发现，AR 的发生与COX-1 基因-1676A＞G 携带的G 等位基因不相关。李霞等[12]研究发现，COX-1 基因-1676A＞G 携带的G 等位基因并未增加AR 的发生，未增高缺血性脑卒中的复发率。

COX-2 基因位于1 号染色体上，与COX-1 相比，COX-2 主要在炎症反应中起作用[13]，可将AA 转化成TXA2，从而促进血小板聚集。有报告认为COX-2-765C 等位基因的突变可能降低阿司匹林的敏感性而造成AR[14]。袁凌[15]通过对450 例缺血性卒中患者进行3 个月随访观察，发现携带COX-2-765C 等位基因的患者AR 的发生率更高，其预后不良。但杨秀峰等[16]研究发现COX-2-765G/C 突变基因型并未增加缺血性脑卒中及心肌梗死的风险。本研究结果显示：AS 组COX-2-765G/C 基因携带C等位基因的频率为11.18%，与其相比，AR组COX-2-765G/C基因携带C等位基因的频率更高（20.46%）；对比AS组患者发生脑梗死（8.82%），AR 组更容易发生脑梗死（18.18%）（P＜0.05）。

综上所述，本研究显示AR 与缺血性脑卒中复发明显相关，但是未来还需要对缺血性脑卒中患者发生AR 与COX-2-765G/C 基因及COX-1-1676A＞G基因之间的相关性进行进一步研究，并且可以选取其他SNP 位点作为研究对象，从而对AR 的基因变异特性进行更加全面的了解，进而为临床治疗提供借鉴和参考。