穴位埋线对多囊卵巢综合征胰岛素抵抗模型大鼠慢性炎症的疗效评价

李慧祯　童丽　陈秀萍　李永平　孙文萍

摘要目的：探討穴位埋线对多囊卵巢综合征胰岛素抵抗（PCOSIR）模型大鼠的疗效。方法：将48只雌性SD大鼠按随机数字表法分为正常组、模型组、二甲双胍组和穴位埋线组，每组8只。除正常组外，其余各组以项背部皮下注射脱氢表雄酮建立PCOSIR模型。按照每组治疗方案进行干预，共28 d。借助HE染色对卵巢组织形态学变化进行观察;酶联免疫吸附试验（ELISA）法对血清空腹胰岛素（FINS）、C反应蛋白（CRP）、黄体生成素（LH）、性激素结合球蛋白（SHBG）和睾酮（T）进行定量，通过相关公式计算稳态模型胰岛素抵抗指数（HOMAIR）和游离雄激素指数（FAI）值。结果：与正常组比较，模型组卵巢组织黄体、正常卵泡少见，闭锁卵泡数增多，闭锁卵泡内见大量的颗粒细胞核固缩、崩解，颗粒层细胞被挤压至边缘，排列无序，见大量囊样扩张卵泡，且大鼠血清FINS、FBG、HOMAIR、CRP、LH、T及FAI水平显著升高（P<0.01），SHBG水平降低（P<0.05）。与模型组比较，各观察组卵巢中黄体量增多，囊泡及闭锁卵泡减少，颗粒层细胞规律排列，尤其联合组各级卵泡数量及发育接近正常，未见囊样改变的卵泡，且大鼠血清FINS、FBG、HOMAIR、CRP、T、FAI、LH水平均显著降低（P<0.01），SHBG水平升高（P<0.05）。结论：穴位埋线可以改善PCOSIR模型大鼠性激素水平、胰岛素抵抗（IR）及慢性炎症状态，该疗法方便简洁、安全性高、不良反应少，值得临床推广。

关键词穴位埋线;多囊卵巢综合征;胰岛素抵抗;慢性炎症;C反应蛋白;游离雄激素指数;性激素结合球蛋白

Effect of Acupoint Catgut Embedding on Chronic Inflammation in Rats with Insulin

Resistance Model of Polycystic Ovary Syndrome

LI Huizhen，TONG Li，CHEN Xiuping，LI Yongping，SUN Wenping

（1 Qinghai Provincial Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Research for Glucolipid Metabolic Diseases，

Xining 810001，China; 2 Qinghai Red Cross Hospital，Xining 810000，China）

AbstractObjective：To investigate the therapeutic effect of catgut embedding at acupoint on insulin resistance（PCOSIR） in rats with ovarian syndrome.Methods：All 48 female SD rats were randomly divided into a normal group，a model group，a metformin group and an acupoint catgut embedding group，eight in each group.Except for the normal group，PCOSIR model was established by subcutaneous injection of dehydroepiandrosterone into the rest of the groups.Interventions were according to each treatment plan，lasting for 28 days.Histomorphology changes of ovary were observed by HE staining; ELISA methods were used to quantify serum FINS，CRP，LH，SHBG and keto testosterone（T）.The HOMAIR and FAI values were calculated with relevant formulas.Results：Comparing with the normal group，ovarian corpus luteum，normal follicles were rare in the model group，with the number of atresia follicles increased and a large number of granulosa cell nuclei shrank and disintegrated in atresia follicles，granulosa cells being squeezed to the margin，arranged disorderedly; and a large number of cystic dilated follicles were found in the model group; serum FINS，FBG，HOMAIR，CRP，LH，T and FAI levels in rats increased significantly（P<0.01） and SHBG levels decreased（P<0.05）.When compared with the model group，the corpus luteum increased，vesicles and atresia follicles decreased; granulosa cells were arranged regularly，especially that the number and development of follicles at all levels in the combined group were close to normal level; and no cystic changes were found; the serum FINS，FBG，HOMAIR，CRP，T，FAI，LH level of rats decreased significantly（P<0.01） and SHBG level increased（P<0.05）.Conclusion：Acupoint catgut embedding therapy can improve the level of sex hormones，IR and chronic inflammation in PCOSIR model rats.This therapy is convenient，simple，safe and it has less side effects.It is worthy of being widely popularized in the clinical application.

KeywordsAcupoint catgut embedding; Polycystic ovarian syndrome; Insulin resistance; Chronic inflammation; CRP; FAI; SHBG

中图分类号：R271.1文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.04.006

多囊卵巢综合征（Polycystic Ovary Syndrome，PCOS）是一种常见的异质性疾病，且多以内分泌紊乱为特征[1]。目前国内育龄期女性PCOS发病率为6%～10%，其中不孕者达30%～60%，严重威胁女性健康并影响家庭幸福[23]。大量研究认为胰岛素抵抗（Insulin Resistance，IR）是PCOS发病的核心，流行病学显示50%～70%的PCOS患者存在IR。另外有研究发现PCOS及PCOSIR患者外周血中炎症介质水平升高，说明该病患者长期处于一种慢性低度炎症状态。目前该病西医治疗方法主要有药物干预和手术治疗，但常有服药后不良反应大和术后附件易粘连等弊端。因此中医治疗PCOS已成为趋势，其中穴位埋线由针灸理论发展而来，通过对穴位的不间断多重长久良性刺激，从而调节机体内在平衡，对许多慢性疾病的疗效是肯定的。现代研究发现，穴位埋线能够能调节多囊卵巢综合征胰岛素抵抗（PCOSIR）大鼠生殖内分泌紊乱，降低雄激素水平，改善大鼠IR情况[45]。还可加速炎症吸收[6]。本课题组前期研究发现，根据中医生殖轴选穴针刺或联合五子衍宗丸可很好地改善PCOSIR大鼠生殖内分泌水平及IR情况[78]。但目前穴位埋线治疗PCOSIR伴慢性炎症的相关报道较少。本实验沿用本团队前期选穴方法对症选穴埋线，观察其对PCOSIR模型大鼠伴慢性炎症的疗效。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1动物健康4周龄SD清洁雌性大鼠32只，体质量（60±5）g。购于西安交通大学医学部实验动物中心，动物许可证编号：SCXK（陕）2018001。实验经青海大学医学院动物福利伦理委员会批准通过（伦理审批号：201801），实验过程严格遵照我国科学技部门颁发的法律文件规范进行。

1.1.2药物注射用油（上海源叶生物科技有限公司，生产批号：16030510）;脱氢表雄酮（上海源叶生物科技有限公司，批号：16082009）、盐酸二甲双胍片（中美上海施贵宝制药有限公司，生产批号：ACA4682）

1.1.3试剂与仪器FINSElisas试剂盒（批号：EELR2466c）、CRPElisas试剂盒（批号：EELR0022c）、LHElisas试剂盒（批号：EELR0026c）、SHBGElisas试剂盒（批号：EELR0883c）、TElisas试剂盒批号：EELR0155c），以上均购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司。血糖仪（江苏鱼跃设备医疗股份有限公司，型号：580）、低温离心机（湖南湘仪有限公司，型号：H2050R）、恒温箱（上海琅玹实验设备有限公司，型号：FCD2000）酶标仪（深圳雷杜医疗有限公司，型號：RT6500）。

1.2方法

1.2.1分组与模型制备适应性饲养2 d后将32只大鼠按随机数字表法分为正常组、模型组、二甲双胍组、穴位埋线组。除正常组外，其余各组SD大鼠颈背部皮下注射溶于注射用大豆油的脱氢表雄酮（DHEA）溶液0.2 mL（6 mg/100 g），10 d后通过巴氏染色观察其阴道上皮细胞形态变化，连续涂片10 d，若此期出现连续角化状态的阴道上皮细胞，则表明健康大鼠成功诱导为PCOS模型，于当晚9：00对PCOS模型大鼠禁食，12 h后眶静脉取血。即刻测空腹血糖及空腹胰岛素水平，计算HOMAIR，以HOMAIR>2.8为胰岛素抵抗标准，进入后续实验。

1.2.2干预方式正常组按20 mL/kg行饮用水灌胃，1次/d，连续28 d;模型组干预方式同正常组;穴位埋线组选择脾俞、胰俞、肾俞、关元、中脘、子宫、三阴交行埋线（定位参照“实验动物穴位图谱”），线长0.5 cm，1次/周，共4次;二甲双胍组给予2 mL二甲双胍溶液灌胃，100 mg/kg，1次/d，连续28 d;治疗期间各组继续注射脱氢表雄酮，以防止其自身恢复排卵。

1.2.3检测指标与方法经腹腔用水合氯醛进行麻醉，行腹主动脉采血，抗凝管置于离心机，离心15 min（3 000 r/min，离心半径6 cm），分离血清，放置在-20 ℃冰箱保存，备用。采血结束，大鼠即刻断颈处死，剥取两侧卵巢，生理盐水清洗后，一侧卵巢以多聚甲醛中固定，另一侧卵巢液氮冷冻，存置-86 ℃冰箱保存，备用。

1.2.3.1卵巢形态观察将固定在多聚甲醛中的卵巢组织常规脱水，石蜡包埋，切片，脱蜡，水化，苏木精染色5 min，分化液分化，伊红染色5 min，脱水，中性树胶封片，显微镜镜检采集图像。治疗周期结束后当晚9：00禁食，12 h后眶静脉取血检测空腹血糖（FBG）和空腹胰岛素（FINS）。

1.2.3.2测定大鼠血清生化指标测定FINS、C反应蛋白（CRP）、黄体生成素（LH）、性激素结合球蛋白（SHBG）和睾酮（T）含量，并计算HOMAIR及游离睾酮（Free Testosterone Index，FAI）指数，FAI=T/SHBG×100。各项指标含量测定严格按照ELISA试剂盒操作说明书。

1.3统计学方法采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，其中计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间采用单因素方差分析，多重两两比较方差齐时采用LSDt检验，方差不齐时采用Tamhane′s T2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1造模期间大鼠阴道脱落细胞形态变化造模组大鼠阴道脱落细胞在2个动情周期（10 d）中呈现连续角化状态，表明PCOS造模成功。见图1。

2.2各组大鼠卵巢形态变化正常组：大鼠卵巢组织被膜完整，可见大量黄体，不同阶段卵泡发育及数量正常，少量闭锁卵泡，未见囊样扩张的卵泡，结缔组织排列紧密;模型组：大鼠卵巢组织被膜完整，黄体数量较少，各级卵泡数量减少，正常卵泡少见，闭锁卵泡数增多，闭锁卵泡内见大量的颗粒细胞核固缩、崩解，颗粒层细胞被挤压至边缘，排列无序，见大量囊样扩张卵泡;穴位埋线组：大鼠卵巢组织被膜完整，可见大量黄体，各级卵泡数量略减少，个别次级卵泡呈囊样扩张，颗粒层细胞少量细胞脱落坏死;二甲双胍组：大鼠卵巢组织被膜完整，可见大量黄体，各级卵泡数量略减少，个别次级卵泡呈囊样扩张，颗粒层细胞排列整齐。见图2。

2.3各组大鼠FBG、FINS、HOMAIR及CRP水平变化与正常组比较，模型组大鼠血清FINS、FBG、HOMAIR及CRP水平均显著升高（P<0.01）;与模型组比较，二甲双胍组和穴位埋线组大鼠血清FINS、FBG、HOMAIR及CRP水平均显著降低（P<0.01）;此2組间差异无统计学意义（P>0.05）。见图3。

2.4各组大鼠LH、SHBG、T、FAI水平变化与正常组比较，模型组大鼠血清LH、T、FAI水平均显著升高（P<0.01），SHBG水平降低（P<0.05）;与模型组比较，二甲双胍组、穴位埋线组小鼠血清T、FAI、LH水平均显著降低（P<0.01），穴位埋线组SHBG水平升高（P<0.05）;二甲双胍组、穴位埋线组差异无统计学意义（P>0.05）。见图4。

3讨论

近几年不断有研究发现，PCOSIR患者长期处于慢性低度的亚临床炎症状态[9]。PCOS及PCOSIR患者无论是否肥胖，炎症介质水平都有不同程度的升高，但是肥胖会加重慢性低度炎症状态[1011]。HA、IR及慢性炎症之间的相互作用关系至今未曾出现统一定论。有学者发现，PCOS慢性非特异性炎症性可以通过影响下丘脑垂体性腺轴功能而引起卵巢功能的受损，也可以通过刺激卵巢而诱发高雄激素血症，同时加重IR[12]。慢性低度炎症也有可能介导交感神经功能障碍对HA和IR的影响，即IR、HA、交感神经功能障碍和慢性低度炎症可能在PCOS的病理生理过程中以恶性循环共同作用[13]。Souza Dos Santos等[14]测定PCOS患者炎症状态及胰岛素抵抗水平后证实PCOS患者CRP及HOMAIR水平升高。CRP是体内最重要的炎症标志物，其可促进其他炎症介质合成分泌并且会扩大机体整体的炎症程度。

中医学认为，肾虚精亏、冲任不足是PCOS发病的主要原因，二者会影响肾天癸冲任胞宫轴功能。肾为气之根本，肾气不足，则使机体正气亏虚，抵御外邪及祛邪外出作用减弱，是PCOS女性体内微炎症存在的内在基础，结合现代临床研究，张晓甦老师提出该病之所以缠绵难愈、易于反复，与其长期存在的微炎症状态密切相关[15]。

穴位埋线的原理当然离不开针灸理论，较普通针刺，穴位埋线则是通过不间断长久良性刺激，起到疏通经络、调节阴阳的作用，从而调节机体内在平衡，对许多慢性疾病的疗效是肯定的。有研究发现穴位埋线在慢性炎症方面的作用机制可能是使神经体液系统发挥一系列的调节作用，提高机体的营养代谢、促进血液循环，进而加速炎症吸收[6]。另外有研究表明穴位埋线可以使PCOS患者的体质量指数（BMI）和IR下降[16]。脾俞、胰俞和肾俞穴，三穴为背腧穴，共奏养胰健脾、补益脾肾、益精填髓之效。电针脾俞和胰俞穴均可有效降低2型糖尿病大鼠的FBG，另外电针胰俞穴可降低2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗、提高其胰岛素敏感指数[17]。肾俞穴为肾之背腧穴，为滋补肾阴的第一要穴。针刺肾俞穴可以通过增加垂体及血清LH、卵泡刺激素（FSH）的含量，即通过调节性激素，使内分泌水平得到恢复[18]。三阴交可同时调理肝、脾、肾三经，也是治疗妇科疾病常用的经验穴，关元穴培元固本、补益下焦;有研究发现对三阴交、关元等穴位电针可改善PCOS大鼠高雄激素血症、调节雄激素受体的表达，还可改善卵泡发育[1920]。由此推断对以上穴位进行穴位埋线，也可调节性激素水平，本实验结果与此相符：子宫穴补益冲任、调摄经血，中脘穴健运脾气、升清降浊。

实验结果显示，对上述穴位进行穴位埋线治疗后大鼠卵巢组织可见大量黄体，较模型组囊样扩张的卵泡数量明显减少，大鼠体内FAI、T、LH等性激素相关水平、胰岛素抵抗指数及CRP水平下调（P<0.01），SHBG水平上调（P<0.05），考虑可能是以上穴位组合后对主要对雄激素起到下调作用，进而改善其胰岛素抵抗与慢性炎症改变;也可能是埋线使神经体液系统发挥一系列的调节作用，使血液循环加速，改善胰岛素抵抗，促使炎症吸收。

综上所述，选肾俞、胰俞、脾俞、三阴交、关元、子宫、中脘等穴进行穴位埋线联合覆盆子治疗PCOSIR伴慢性炎症效果显著。二者联合后可能同时改善了胰岛素抵抗、高雄激素水平及慢性炎症状态，但HA、IR及慢性炎症之间的相互作用关系仍无法明确，可能其中有某种信号通路的参与，因此对于以上三者的关系及可能的相关信号通路还有待进一步研究。

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基金项目：中医药高层次人才培训基地建设项目（国中医药人教函[2019]128号）;青海省卫健委中藏医药研究课题（2019wjzdx69）——针药干预对PCOSIR模型大鼠慢性炎症的分子机制研究

作者简介：李慧祯（1996.08—），女，硕士研究生在读，研究方向：针刺效应机制研究，Email：1573788685@qq.com

通信作者：李永平（1978.08—），男，硕士，副教授，研究方向：针灸效应机制研究，Email：liyongping1122@163.com