肝癌外周血单核细胞表面TLR2、TLR4水平与小肠细菌过度生长的关系研究

王 楠 李梦华 张锦伟

（大连市公共卫生临床中心（大连市第六人民医院），辽宁 大连 116031）

原发性肝癌（primary carcinoma of the liver，PLC）作为一种发病率较高的恶性肿瘤，会严重威胁患者的生命安全[1]。目前，该疾病主要分为胆管细胞癌、肝细胞癌与混合型3种类型。其中，肝细胞癌占PLC的85%～90%。肝癌的病理学基础为病毒感染等各种致癌因素所诱发的肝纤维化、肝脏慢性炎症与肝硬化。据流行病学显示，我国80%～90%的肝癌患者均有HBV感染病史，慢性炎症的持续刺激在肝细胞癌的发生、发展中也起着十分重要的作用。目前，肝癌诊疗技术研究取得了较大的进展，靶向药物治疗方案也在持续完善，临床疗效总体大幅度提升，但仍旧无法达到理想的治疗效果。为此，临床工作者应深入探究肝癌的发病机制，寻找出一种更加有效的治疗方法。相关研究报道显示，慢性肝病患者在发病期间存在小肠细菌过度生长现象，内毒素血症的发生率明显高于健康人群[2]。同时，慢性重型乙型肝炎外周血单核细胞TLR2、TLR4的表达明显升高[3-4]。本次研究选取了3组观察对象，主要就肝癌外周血单核细胞表面TLR2、TLR4水平与小肠细菌过度生长关系展开了研究与报道。

1 资料与方法

1.1 一般资料 研究对象为2017年3月至2019年3月在我院治疗的45例乙肝相关性肝癌患者与35例慢性乙肝型肝炎患者以及15例健康体检患者，将其分别设为研究组A 45例，研究组B 35例，参照组15例。研究组A，男30例，女15例，平均（42.20±10.60）岁；研究组，男25例，女10例，平均（45.20±9.50）岁；参照组，男10例，女5例，平均（49.90±8.80）岁。患者自愿签署知情同意书。3组组间比较差异无统计学意义，P＞0.05。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂 Alexa Fluor®488 mouse Anti-HUMAN CD282、Alexa Fluor®488 mouse IgG1 Κ、PE mouse Anti-Human TLR4（CD284）、PE mouse IgG1、APC Mouse Anti-Human CD14、红细胞裂解液（北京索莱宝科技有限公司）；显色基质鲎试剂（上海榕柏生物技术有限公司）；乳果糖口服液杜密克[Abbott Biologicals B.V.（荷兰）]。

1.2.2 主要仪器 流式细胞仪，FACSCalibur（美国Becton Dickinson公司）；SC-2546低速离心机（济南存昌生物技术有限公司）；EC60Gastrolyzer型氢呼气检测设备（上海亿人环保科技发展有限公司）；HWC-52型恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）；分光光度计（北京京创泰宁伟业科技发展有限公司）；BIO-RAD680酶标仪（北京泰泽嘉业科技发展有限公司）。

1.2.3 小肠细菌过度生长检测 采血当天受试者接受乳果糖氢呼气检测。要求患者在检测前一晚禁食奶制品与豆制品等食物，确保患者保持隔夜空腹长达12 h以上。患者于测试当日晨起完成刷牙、排便，饮用温水50 mL。禁止吸烟、剧烈活动，保持统一坐姿。

检测人员于检测前认真校正检测仪器，检测氢气浓度时，要求患者保持空腹，口服乳果糖10 g，饮50 mL温开水，隔15 min检测1次，不间断检测2 h。具体值以患者每次呼气后，显示屏上数字停止变动为主，每次最少2次。若基础呼气浓度＞20 ppm，或者90 min内任何一个峰值＞基础值20 ppm，SIBO为阳性，＜基础值20 ppm为阴性。

1.3 观察指标 ①观察、对比3组SIBO阳性率、外周血内毒素浓度。②比较研究组A合并SIBO阳性组与SIBO阴性组外周血CD14+单核细胞表面TLR2、TLR4。③对比研究组A外周血CD14+单核细胞表面TLR2、TLR4表达水平与外周血内毒素相关性。

1.4 统计学分析 研究数据用SPSS 21.0统计学软件处理，计数资料、计量资料分别用χ2、t检验，P＜0.05，证明比较数据有意义。

2 结果

2.1 SIBO阳性率比较 研究组A：阳性33例，阴性12例，阳性率73.33%；研究组B：阳性10例，阴性 25例，阳性率28.57%；参照组：阳性1例，阴性14例，阳性率6.67%；研究组A的SIBO阳性率明显高于研究组B与参照组（χ21=38.735，χ22=74.305，P＜0.05），研究组B的SIBO阳性率高于参照组，差异有统计学意义（χ2=11.391，P＜0.05）。

2.2 外周血CD14+单核细胞表面TLR2、TLR4所占的比例的比较 与研究组B与参照组比较，研究组A的外周血CD14+单核细胞表面TLR2+、TLR4+细胞所占比例明显较高（P＜0.05）；研究组B的细胞所占的比例与参照组比较，差异有显著性（P＜0.05），见图1。

图1 研究组A、研究组B与参照组外周血CD14+单核细胞表面TLR2+、TLR4+细胞所占比例流式检测图

2.3 外周血CD14+单核细胞表面TLR2+、TLR4+细胞GMF比较 对比研究组B与参照组，研究组A的外周血CD14+单核细胞表面TLR2+、TLR4+细胞GMF明显较高（P＜0.05）；研究组B的外周血CD14+单核细胞表面TLR4+细胞GMF参照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），而TLR2+细胞GMF无显著性差异（P＞0.05），见图2。

图2 研究组A、研究组B与参照组外周血CD14+单核细胞表面TLR2+、TLR4+细胞GMF的流式检测图

2.4 外周血内毒素浓度比较 研究组A的血浆内毒素水平均显著高于研究组B与参照组，（P＜0.05）；乙肝肝癌合并SIBO阳性者内毒素水平明显高于SIBO阴性患者，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

2.5 研究组A外周血CD14+单核细胞表面TLR2、TLR4表达水平与外周血内毒素相关性比较 研究组A的TLR2+细胞的比例、GMF与内毒素浓度呈正相关（r值分别为0.372、0.461，P＜0.05）；研究组A的TLR4+细胞比例、GMF与内毒素浓度呈正相关（r值分别为 0.651、0.804，P＜0.05）。

3 讨 论

现阶段，基因和细胞因子水平是乙肝病毒与肝癌关系研究中的重点，且多项报道称，免疫系统介导的炎性反应与肠道微生态的改变在慢性肝病进展中具有十分重要的作用，这就促使免疫因素与炎症成为该领域的研究重点。

表1 各组间CD14+单核细胞表面TLR2、TLR4的表达及内毒素的比较（±s）

表1 各组间CD14+单核细胞表面TLR2、TLR4的表达及内毒素的比较（±s）

注：研究组A与参照组对比，aP＜0.05；研究组A与研究组B对比，bP＜0.05；研究组B与参照组比较，cP＜0.05；研究组B SIBO阳性与阴性比较，dP＜0.05；研究组A SIBO阳性与阴性比较，eP＜0.05。

在正常细胞发生癌变的过程中，由细菌与病毒微生物引发的慢性炎症发挥着重要作用。一般情况下，约70%流入肝脏的血液来源于肠道-门静脉系统，此路径会提供多种机会让肝脏接触到携带有肠源性病原微生物的代谢产物。通常情况下，受肝脏自身免疫耐受这一特点的影响，肝脏并无明显的炎性反应，但当免疫耐受遭受到破坏后，异常免疫反应就会表现出来，引发各种肝脏疾病。有研究显示，TLRs参与了宿主抗病原微生物的免疫应答过程，与病毒性肝及肝癌之间具有明显的相关性，在肝病诊治中具有较高的研究价值。TLRs作为重要的模式识别受体家族成员，在多种肿瘤细胞表达中，TLRs受体均有体现。同时，因乙肝病毒等因素诱发的慢性持续性肝损伤，也可通过TLRs对DAMPs、PAMPs进行识别，在天然免疫中发挥免疫监视的作用，或者也可通过APC，触发获得性免疫，在获得性免疫与天然免疫中发挥桥梁作用。另外，TLRs在其生理、病理过程中也有参与表现，如促肝纤维化，防止上皮损伤，促肿瘤生长，抗凋亡，促进上皮再生及生长与血管生成等。肝脏中的肝细胞、肝窦内皮细胞、树突状细胞、库普弗细胞、肝星状细胞等均可表达出多种TLRs。在最近几年里，有学者在肠-肝轴研究中发现，肠道微生态在慢性肝病发展为肝癌的过程中极有可能发挥着十分重要的作用，这也为肝癌治疗提供新的思路与方法。

本次研究数据结果显示，研究组A患者的外周血内毒素浓度明显高于研究B与参照组；SIBO阳性患者的内毒素水平，相比于SIBO阴性患者，明显较高，与外周血单核细胞表面TLR2、TLR4水平呈正相关。因人体肝脏内的Kupffer细胞可以将内毒素清除[5]。特别是慢性肝病患者的肝功能损伤严重时，其清除肉毒素能力会明显被削弱，导致内毒素大量进入血液循环系统，引起内毒素血症[6-7]。再加上患者小肠内的细菌过度生长，菌群代谢速度加快，肠黏膜屏障功能就会遭受到不同程度的破坏[8]，内毒素也会发生位移，促使SIBO阴性患者体内内毒素水平显著低于合并SIBO患者[9-10]。另外，毒素脂多糖具有TLRs激动剂的作用，可以诱导My D88与TLRs之间发生相互作用[11-12]，充分刺激下游NF-κB信号途径，进而产生炎性介质，加快肝癌细胞增值，提高肝癌细胞存活率[13]。由此可知，TLR2、TLR4信号通路介导的炎性因子在疾病发生与发展过程中均发挥着十分重要的作用[14-15]。

综上所述，在诊断与治疗肝癌与慢性乙型肝炎过程中，病毒感染是TLR2、TLR4高表达的初始因素，内毒素上调单核细胞TLR2、TLR4的表达参与了SIBO的发生，单核细胞表面TLR2、TLR4水平的表达上调则会引发SIBO，由此可知，TLR2、TLR4与SIBO等相关因素之间是互相作用的[16]，且在慢性乙型肝炎向肝癌发展期间发挥着较大的作用[17-18]。为此，在治疗肝癌的过程中，要从调节肠道菌群，阻断TLR2、TLR4的炎症信号通路这两大方面入手[19]，以此来抑制慢性肝病的进程，减缓向肝癌的发展速度[20]，但由于此项研究内容还不够成熟，处于试验研究阶段，因此需要大量的临床试验与充足的样本进行进一步的验证。