芍药苷通过抑制TGF-β1/Smad3通路对急性心肌梗死后心室重塑的作用研究

闫 娜，杨 妮，董 晗，魏 平

(1. 延安大学附属医院，陕西 延安 716000;2. 西安交通大学第二附属医院，陕西 西安 710004;3. 西安交通大学基础医学院，陕西 西安 710049)

急性心肌梗死是由冠状动脉急性、持续性缺氧缺血导致的一种心肌坏死。尽管早期溶栓、经皮冠状动脉介入或冠状动脉旁路移植术治疗降低了急性心肌梗死相关的病死率，但存活的患者多数会出现左室重塑现象[1]。心肌梗死后这种不良的心室重塑可导致心室功能不全和心力衰竭，最终导致疾病预后差和病死率高[2]。目前，心肌梗死的主要治疗药物有血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素I型受体阻滞剂和β-肾上腺素能阻滞剂[3]，但这些治疗药物对于预防心肌梗死后左室重构的有效性仍然十分有限。因此有必要开发新的治疗药物，以保护心肌梗死患者免受心室重塑的影响。芍药苷是常用中药牡丹、白芍和赤芍的主要有效成分，是一种单萜苷类化合物。Chen等[4]的研究表明，芍药苷可减少大鼠心肌缺血/再灌注损伤时的梗死面积，改善血流动力学参数，降低肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和核因子-κB(NF-κB)的表达水平。然而，芍药苷能否改善急性心肌梗死后心室重塑及其可能的机制尚待阐明。转化生长因子-β1(TGF-β1)被认为是心肌纤维化的关键调节因子，其可影响细胞生长、凋亡和分化，增加胶原和基质蛋白的产生，维持成纤维细胞的活力，抑制金属蛋白酶的产生[5-6]。有研究表明，芍药苷可通过调节TGF-β1/Smads信号通路，减轻肝损伤，减少胶原沉积，抑制辐射性肝纤维化[7]。本研究基于TGF-β1/Smad3通路探讨了芍药苷对急性心肌梗死后心室重塑的影响，以期为明确芍药苷对心肌梗死后心室重塑的作用机制提供新的科学依据。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 40只健康清洁级雄性SD大鼠，体质量200～240 g，购自西安交通大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK(苏)2018-0008。所有SD大鼠于动物房中饲养，环境温度20～24 ℃，保持环境通风，及时清理粪便、更换垫料，提供充足饮水及饲料。

1.2主要试剂及仪器 芍药苷购自成都埃法生物科技有限公司；曲美他嗪购自天津施维雅制药有限公司；2%TTC染色液和Masson试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、TGF-β1和p-Smad3抗体购自英国Abcam公司；Smad3抗体购自美国Cell Signaling Technology；GAPDH和HRP标记二抗购自武汉Proteintech公司；Super ECL Detection Reagent ECL化学发光超敏显色试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司；IL-6 和TNF-α ELISA检测试剂盒购自上海纪宁实业有限公司。Vevo 2100超高分辨率小动物超声影像系统购自加拿大VisualSonics公司；光学显微镜购自日本Nikon；MultiskanTMFC 酶标仪购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

1.3实验方法 待大鼠适应环境1周后，将其随机分为5组各8只。参考文献[8]，结扎模型组、曲美他嗪组、芍药苷低剂量组和芍药苷高剂量组大鼠冠状动脉左前降支，建立急性心肌梗死模型。假手术组除不进行手术结扎外，其余手术操作与模型组一致。手术后24h，曲美他嗪组大鼠给予曲美他嗪10 mg/(kg·d)灌胃，芍药苷高、低剂量组大鼠分别给予芍药苷10 mg/(kg·d)和5 mg/(kg·d)灌胃，假手术组和模型组灌胃生理盐水，均连续4周。

1.4检测指标与方法

1.4.1心功能评估 末次灌胃24 h后，10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠。使用21 MHz高频探头在标准设置下进行二维经胸超声心动图检查，在3个连续的心动周期内测量左心室舒张末期内径(LVIDd)、左心室收缩末期内径(LVIDs)、左室舒张末期容积(LVEDV)、左室收缩末期容积(LVESv)、射血分数(EF)、左室短轴缩短分数(FS)。EF=(LVEDv-LVESv)/LVEDv×100%，FS=(LVEDd-LVESd)/LVEDd×100%。

1.4.2血清炎症因子水平检测 超声检查结束后，尾静脉抽取静脉血，1 000×g离心20 min收集血清，按照试剂盒说明书检测各组大鼠血清IL-6和TNF-α水平。

1.4.3TTC染色心肌梗死面积评估 各组8只大鼠取血后立即取出心脏，于-20 ℃条件下冷冻15 min，将心脏切片。心脏切片在37 ℃的1%TTC染色液中孵育15 min，红色表示正常心肌组织，白色表示心肌梗死区域。用Image Pro-Plus图像分析软件分析梗死面积。

1.4.4HE染色心肌结构观察 取8只大鼠心脏，4%多聚甲醛固定72 h，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋、切片。石蜡切片常规二甲苯、乙醇脱蜡至水，苏木素染色10 min，0.7%盐酸乙醇分化数秒，流水洗涤后，伊红液浸染3 min。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察分析。

1.4.5Masson染色心肌胶原沉积情况观察 石蜡切片常规脱蜡至水，苏木素染液染色10 min。酸性乙醇分化液分化15 s，水洗。Masson蓝化液返蓝5 min，水洗。丽春红品红染液10min。磷钼酸溶液洗1 min，弱酸工作液洗1 min。苯胺蓝染液染色2 min。弱酸工作液洗后，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，光学显微镜下观察分析。

1.4.6Western blot法心肌组织中TGF-β1、p-Smad3表达水平检测 取8只大鼠，把心脏组织剪切成细小的碎片，RIPA裂解液裂解组织，离心取上清，BCA法测定蛋白浓度。取20μg蛋白进行SDS-PAGE分离，并转至PVDF膜上。10%脱脂奶粉封闭，随后加入Ⅰ型胶原(1∶5000)、Ⅲ型胶原(1∶1 000)、TGF-β1(1∶500)、p-Smad3(1∶1 000)、Smad3(1∶500)抗体和GAPDH(1∶5 000)抗体，4 ℃条件下过夜孵育。随后加入HRP标记二抗(1∶5 000)，室温孵育1 h后，滴加ECL工作液到膜上，化学发光成像仪检测。

2 结 果

2.1各组大鼠心功能比较 与假手术组比较，模型组大鼠EF和FS均显著降低(P均<0.05)，LVIDs和LVIDd均显著升高(P均<0.05)；与模型组比较，曲美他嗪组、芍药苷低剂量组和芍药苷高剂量组大鼠EF和FS均显著升高(P均<0.05)，LVIDs和LVIDd均显著降低(P均<0.05)，且芍药苷高剂量组改善情况优于芍药苷低剂量组(P均<0.05)。见表1。

表1 假手术组和急性心肌梗死各组大鼠心功能比较

2.2各组大鼠血清炎性因子水平比较 模型组大鼠血清TNF-α和IL-6水平均显著高于假手术组(P均<0.05)；曲美他嗪组、芍药苷低剂量组和芍药苷高剂量组大鼠血清TNF-α和IL-6水平均显著低于模型组(P均<0.05)，且芍药苷高剂量组均显著低于芍药苷低剂量组(P均<0.05)。见表2。

表2 假手术组和急性心肌梗死各组大鼠血清TNF-α和IL-6水平比较

2.3各组大鼠心肌梗死面积比较 模型组、曲美他嗪组、芍药苷低剂量组和芍药苷高剂量组大鼠心肌梗死面积分别为(45.82±7.89)%、(15.27±2.05)%、(33.15±4.14)%、(24.51±3.47)%，曲美他嗪组、芍药苷低剂量组和芍药苷高剂量组均显著低于模型组(P均<0.05)，且芍药苷高剂量组显著低于芍药苷低剂量组(P<0.05)。

2.4各组大鼠心肌结构比较 HE染色显示，假手术组大鼠肌原纤维排列整齐，有连续性，见图1；模型组大鼠肌原纤维排列紊乱，有明显炎性细胞浸润和间质水肿，见图2；曲美他嗪组、芍药苷低剂量组和芍药苷高剂量组大鼠胶原纤维排列趋于整齐，炎性细胞浸润和间质水肿明显减少，且芍药苷高剂量组改善更明显，见图3～5。

图1 假手术组大鼠心肌结构HE染色表现(×400)

图2 模型组大鼠心肌结构HE染色表现(×400)

图3 曲美他嗪组大鼠心肌结构HE染色表现(×400)

图4 芍药苷低剂量组大鼠心肌结构HE染色表现(×400)

图5 芍药苷高剂量组大鼠心肌结构HE染色表现(×400)

2.5各组大鼠心肌纤维化情况比较 模型组大鼠心肌胶原沉积面积和Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原表达水平显著高于假手术组(P均<0.05)，曲美他嗪组、芍药苷低剂量组和芍药苷高剂量组均显著低于模型组(P均<0.05)，且芍药苷高剂量组均显著低于芍药苷低剂量组(P均<0.05)。见图6～7及表3。

2.6各组大鼠心肌组织中TGF-β1、p-Smad3表达情况比较 模型组大鼠心肌组织中TGF-β1、p-Smad3表达量均显著高于假手术组(P均<0.05)，曲美他嗪组、芍药苷低剂量组和芍药苷高剂量组均显著低于模型组(P均<0.05)，且芍药苷高剂量组均显著低于芍药苷低剂量组(P均<0.05)。见图8及表4。

3 讨 论

心室重塑包括心肌肥厚和纤维化，是血流动力学超负荷的病理改变，与高血压和其他心血管疾病有关[9]，它是许多心血管事件的独立危险因素。目前研究认为心肌肥厚和纤维化程度与心力衰竭患者的病死率密切相关[10]，对于高血压、心肌梗死或其他心血管疾病患者，在疾病早期抑制心室重塑是延缓心力衰竭的有效途径[11]。

图6 假手术组和急性心肌梗死各组大鼠Masson染色心肌胶原沉积情况(×200)

1为假手术组；2为模型组；3为曲美他嗪组；4为芍药苷低剂量组；5为芍药苷高剂量组图7 假手术组和急性心肌梗死各组大鼠心肌Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原表达情况

表3 假手术组和急性心肌梗死各组大鼠心肌胶原沉积面积及心肌组织中Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原相对表达水平比较

芍药苷具有多种生物学功能，包括抗炎、抗凋亡、抗氧化应激和抑制血小板聚集、血栓形成、动脉粥样硬化等[12-13]。有研究证明，芍药苷可抑制IL-6、TNF-α和IL-1β的产生，改善左心室功能，减轻心肌缺血再灌注损伤[14]。另有研究表明，芍药苷可抑制TNF-α和IL-1β炎性因子的表达，从而减少LPS刺激造成的小鼠死亡[15]。本实验结果显示，模型组大鼠心功能受损，心肌有明显炎性细胞浸润、间质水肿和胶原沉积，血清TNF-α、IL-6水平和心肌组织中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原表达水平显著增高；芍药苷干预可改善急性心肌梗死大鼠心功能，减少心肌梗死面积，抑制胶原沉积和炎性因子的表达，在急性心肌梗死中发挥抗炎和心肌保护作用。

1为假手术组；2为模型组；3为曲美他嗪组；4为芍药苷低剂量组；5为芍药苷高剂量组图8 假手术组和急性心肌梗死各组大鼠心肌组织中TGF-β1/Smad3信号通路相关因子表达情况

表4 假手术组和急性心肌梗死各组大鼠心肌组织中TGF-β1、p-Smad3相对表达量比较

TGF-β参与骨形成过程、心脏瓣膜形成、纤维化进程和癌症进程，其与肝、肺、肾和心脏纤维化的进展密切相关，抑制TGF-β表达可阻滞纤维化的发展[15]。Xu等[16]研究报道，水苏碱可通过抑制TGF-β1/Smads通路逆转横主动脉缩窄导致的心肌胶原沉积，抑制心肌纤维化。Zhou等[17]报道，芍药苷的心脏保护作用与抑制TGF-β/Smads和NF-κB途径有关。Liu等[18]研究发现，芍药苷可通过抑制TGF-β1/Smad通路，减少胶原产生，从而减轻慢性心力衰竭大鼠心室重塑。本实验结果表明，模型组大鼠心肌组织中TGF-β1、p-Smad3表达水平显著增高，芍药苷干预后心肌组织中TGF-β1、p-Smad3表达水平均显著降低，提示芍药苷可抑制TGF-β1/Smad3通路，与上述研究结果一致。

综上所述，芍药苷可通过抑制TGF-β1/Smad3通路改善急性心肌梗死后心室重塑，为进一步明确芍药苷在急性心肌梗死中的作用机制及开发新的心肌梗死治疗药物提供了新的科学依据。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。