禽用乳酸菌SR1发酵条件优化
2022-04-02白长胜
白长胜
(黑龙江省农业科学院 畜牧兽医分院,黑龙江 齐齐哈尔 161005)
乳酸菌是我国饲料添加剂品种目录(2013)中允许在养殖动物过程中使用的主要益生菌。在养殖家禽过程中,饲喂乳酸菌可维持消化道微生态平衡,拮抗和抑制肠道有害菌;提高免疫力,增强抗病力;提高家禽对饲料的消化吸收,促进家禽生长[1-3]。乳酸菌在家禽生产中的应用前景十分广阔,因此研究和开发禽用乳酸菌制剂具有重要意义。
乳酸菌活菌制剂要充分发挥其生产性能,实现良好的益生作用,需要有足够的活菌数[4]。乳酸菌种类众多、性状差异较大[5],因此针对特定的乳酸菌有必要对其发酵工艺进行系统优化,才能充分发挥其性能。温度影响菌体生长和酶活,pH影响菌体对营养物质的吸收和酶活,接种量影响生长周期,因而研究出合适的发酵条件降低成本和缩短生产周期,才能推动其在工业中的应用。笔者针对筛选到的一株禽用乳酸菌SR1,通过单因素和正交实验,优化乳酸菌SR1的培养条件,为SR1在禽的养殖过程中的推广应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材 料
1.1.1 菌 种
乳酸菌SR1,经鉴定为乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici),保存在黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院微生物实验室。
1.1.2 试 剂
葡萄糖,K2HPO4,MgSO4为国药试剂分析纯;牛肉膏,蛋白胨为国药试剂生化纯。
1.1.3 培 养 基
乳酸菌计数培养基:MRS培养基。
发酵培养基(质量浓度):葡萄糖30 g/L,牛肉膏5 g/L,蛋白胨10 g/L,K2HPO42 g/L,MgSO40.2 g/L。
1.2 仪 器
ME104电子天平,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;HW-80电热恒温培养箱,杭州绿博仪器有限公司;DL-CJ-2ND超净工作台,北京东联哈尔滨仪器制造有限公司;UV-5200紫外可见分光光度计,上海元析仪器有限公司;YXQ-LS-30SⅡ立式压力蒸汽灭菌器,上海博迅实业有限公司;FE20K实验室pH计,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。
1.3 方 法
1.3.1 初始发酵条件
将SR1菌株活化,挑取1环接种于发酵培养基中,在35 ℃条件下,静置培养24 h;按体积分数为2%接种于新鲜发酵培养基中,35 ℃下静置培养24 h。
1.3.2 发酵条件优化单因素实验
以发酵液中OD660为考核指标,研究因素分别为A(温度)、B(接种量)和C(初始pH)对乳酸菌SR1发酵的影响[5-7]。其中温度分别为20,25,30,35,40,45,50 ℃;接种量分别为1%,3%,5%,7%,9%;初始pH分别为3,3.5,4,4.5,5,5.5,6,6.5,7,7.5。
1.3.3 发酵条件优化正交实验
单因素实验结果温度为40 ℃,接种量为6%,初始pH为6,根据发酵条件单因素优化实验结果,设计3因素3水平的L9(33)正交实验,进一步优化SR1发酵条件[5-7],正交实验设计如表1所示。
表1 乳酸菌SR1发酵条件优化正交实验设计表
1.3.4 验证实验
根据正交实验优化后的发酵条件进行SR1发酵实验,与采用原始发酵条件的发酵结果进行比较。
1.3.5 检测条件确定
以自来水作为空白对照调零,测定发酵培养基和乳酸菌SR1发酵液在不同波长下的OD值,确定乳酸菌SR1的最适吸收波长[8]。
将SR1发酵液用发酵培养基稀释,以未接种发酵培养基作空白对照,测定各稀释度SR1发酵液在最适吸收波长条件下的OD值;同时各稀释度发酵液进行活菌计数,建立活菌数和OD之间的直线回归方程。
1.3.6 分析方法
1) 菌液浓度测定,分光光度计测定OD660值;2) pH直接用pH计测定;3) 活菌计数[9-11],发酵液梯度稀释后,选取适宜稀释度的发酵液涂布MRS平板,35 ℃培养48 h后计数。
1.3.7 数据处理
使用Excel绘图,采用SPSS对数据进行分析。
2 结果与分析
2.1 检测条件确定
不同的菌液,最适吸收波长不同。对乳酸菌的相关研究中,通常采用600 nm波长测定菌液OD,本研究通过实验确定SR1的最适吸收波长为660 nm。
在一定OD范围内,发酵液的活菌数与OD之间成线性关系。通过实验建立SR1活菌数与OD660的直线回归方程:y=2.147x-0.017,R2=0.998。x=OD,y=活菌数(108CFU/mL),OD为0.2～1.6,SR1发酵液的OD与活菌数之间呈线性关系。测定SR1菌液的OD值可以快捷、准确地知道活菌数。
2.2 发酵条件单因素优化
2.2.1 温度对SR1发酵的影响
温度影响微生物体内的许多生化反应,从而影响微生物的代谢活动。低温时菌体生长繁殖受到抑制,在一定温度范围内,随着温度升高,生化反应速率加快,超过一定温度限度,菌体受到抑制,甚至死亡。温度对SR1发酵的影响如图1所示。
图1 温度对SR1发酵的影响Fig.1 Effects of temperature on SR1 fermentation
由图1可知:当温度从20 ℃升高到40 ℃时,OD660从0.295增加到1.431,提高了4.85倍;之后温度继续上升,OD660迅速下降,在50 ℃时降到0.168,只有最高值的24%,可见培养温度过高或过低都会对乳酸片球菌SR1的生长产生显著影响,可能是温度影响微生物体内生化反应过程中酶的活性,进而影响微生物的生长代谢。故选择SR1最适发酵温度为40 ℃。
2.2.2 接种量对SR1发酵的影响
接种量的多少直接影响发酵周期。一般情况下,接种量和微生物的生长过程的适应期成反比,接种量过少导致发酵周期延长,接种量增加则发酵周期减少,但是接种量过多也没有必要,因为种子培养费时,且由于移入的代谢产物过多,改变了发酵培养基的初始环境,也可能延缓菌体早期的生长,从而影响正常发酵。接种量对SR1发酵的影响如图2所示。
图2 接种量对SR1发酵的影响Fig.2 Effects of inoculation amount on SR1 fermentation
由图2可知:随着接种量的增加,乳酸菌SR1的OD660不断增加,在接种量为6%时,OD660达到最大,然后随着接种量继续增加,OD660逐渐下降。其原因可能是接种量在6%时,菌体可充分利用发酵培养基中的营养成分,接种量大于或小于6%均不利于菌株生长;综合来看,当接种量为2%～10%,对OD660的影响不大。考虑到在接种量为6%时,OD660相对最高,因此选择6%为最佳接种量。
2.2.3 初始pH对SR1发酵的影响
pH影响微生物体内酶的活性,从而影响菌体的新陈代谢;pH影响细胞膜所带电荷状态,使细胞膜的通透性改变,从而影响微生物的吸收和排泄;pH影响发酵培养基中某些营养成分的解离,从而影响菌体对这些成分的吸收利用,因此各种微生物都有其最适pH值和一定的pH范围。初始pH对SR1发酵的影响如图3所示。
图3 初始pH对SR1发酵的影响Fig.3 Effects of initial pH on SR1 fermentation
由图3可知:当初始pH为3和3.5时,OD660几乎为零,说明菌体基本不生长;当pH为4时,OD660为0.053,随着初始pH的升高,OD660随之增加,当初始pH为6时,OD660达到最大值,为1.461,是初始pH为4时的27.57倍;然后随着初始pH继续增加,OD660开始逐渐下降,当初始pH为7.5时,OD660为1.321,是最大值的90.42%。当初始pH低于4时,乳酸片球菌SR1生长停滞甚至死亡,在弱碱性至弱酸性环境下均可以正常生长,在弱酸性环境更有利于乳酸菌的生长。故选择SR1最适初始pH为6。
2.3 发酵条件优化正交实验
根据单因素实验结果,以OD660值为考察指标,进行3因素3水平正交实验。发酵条件优化正交实验结果与分析如表2所示。
表2 发酵条件优化正交实验结果与分析
由表2中极差可知:正交实验各因素对乳酸片球菌SR1发酵结果影响顺序为A>C>B,说明温度和初始pH对乳酸片球菌SR1的发酵影响显著。根据K1,K2和K3,可知SR1发酵条件的最优组合为A3B3C2,即温度为42 ℃,接种量为7%,初始pH为6。
2.4 验证实验
乳酸菌SR1分别采用原始发酵条件和优化后的发酵条件进行发酵实验,发酵实验结果如表3所示。
表3 不同发酵条件对SR1发酵的影响
由表3可知:发酵条件优化后,OD从1.404±0.012提高到1.541±0.011,活菌数从(3.0±0.025)×108CFU/mL提高到(3.3±0.024)×108CFU/mL,活菌数差异极显著(p<0.01),说明优化发酵条件可显著提高SR1的发酵液中的活菌数,从而提高SR1的发酵水平,同时OD和活菌数符合通过实验确立的直线回归方程。
3 结 论
采用单因素和正交实验对乳酸片球菌SR1的发酵条件进行优化,确定最佳发酵条件:温度为42 ℃,接种量为7%,初始pH为6,对优化结果进行发酵实验验证,优化后OD660从1.404±0.012提高到1.541±0.011,活菌数从(3.0±0.025)×108CFU/mL提高到(3.3±0.024)×108CFU/mL,提高了10.0%,发酵条件优化前后活菌数差异极显著(P<0.01),说明优化发酵条件可以显著提高SR1发酵水平,为后期SR1在禽的养殖过程中应用奠定基础。结果表明:通常采用600 nm波长检测乳酸菌液OD,实验中SR1最适检测波长为660 nm。不同的微生物检测波长不同可能与菌体的体积、形状有关;常用平板计数法进行活菌计数,该法结果准确,但操作复杂,不能及时得到结果。在一定OD范围内,菌体的OD与活菌数之间成线性关系,测定OD可以计算出活菌数,比平板计数法更便捷、迅速。
