星点设计-效应面法优化mPEG-PLGA 嵌段共聚物空白纳米粒的制备工艺

张卫敏，贾莉，赵鲁亚，李丽平，李伟男

1.菏泽医学专科学校，山东 菏泽 274000；2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040

聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸（mPEG-PLGA）由亲水嵌段PEG 和疏水嵌段PLGA 共同组成。PLGA 在体内可生物降解、且降解的同时将包载的药物缓慢地释放，被广泛用作递药载体［1］。兼具亲水性和生物相容性的PEG 被引入mPEG-PLGA 嵌段共聚物后［2］，因巨噬细胞对纳米粒的吞噬作用减弱，进而促进纳米粒体内长循环，增加纳米粒包载的药物在靶部位的蓄积［3］。纳米粒作为递药载体在靶向治疗方面被广泛应用，但非载药的空白纳米粒对靶向治疗也具有重要意义，实验研究中常作为对照组证明载药纳米粒的治疗作用［4］。本研究对挥发法制备的mPEG-PLGA 空白纳米粒的处方及工艺进行了一定的筛选及优化，为后续制备载药纳米粒奠定相应的基础。

1 材料与仪器

mPEG-PLGA（分子量分别为2 000 Da:12 000 Da、2 000 Da:18 000 Da、2 000 Da:38 000 Da，济南代罡生物科技有限公司）；丙酮（天津市星月化工有限公司）；吐温-80（Tween 80，天津市致远化学试剂有限公司）；聚乙烯醇（PVA，哈尔滨市振杰科技发展公司）；泊洛沙姆188（Poloxamer 188，德国巴斯夫公司），其他试剂均为分析纯。

ME204E 电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；DF-101S 集热式磁力搅拌器（上海秋佐科学仪器有限公司）；Zetasizer nano ZSP 动态光散射仪（英国马尔文公司）；低温高速离心机（上海市离心机械研究所）。

2 方法

2.1 挥发法制备空白纳米粒的工艺

采用乳化挥发法制备空白纳米粒的操作如下［5］：精密称取某一分子量的mPEG-PLGA，于丙酮中超声溶解作为油相；乳化剂溶液作为水相。一定转速进行磁力搅拌的同时，将油相缓慢滴入到水相中。室温持续搅拌直至丙酮完全挥发。低温高速离心后，弃去上清液，将沉淀水洗3 次，制得最终的纳米粒。

2.2 单因素影响因素实验

保持处方及工艺中其他因素不变，分别对mPEG-PLGA 的分子量和浓度、油相与水相比例、不同乳化剂和浓度、磁力搅拌速率、离心过滤方式等处方及工艺的主要影响因素进行考察，以粒径大小（size）、多分散系数（Polymer dispersity index，PDI）为考察指标，筛选制备条件，确定星点设计-效应面法（CCD-RSM）的影响因素以及水平。

2.2.1 mPEG-PLGA 分子量的选择考察不同mPEG比例的嵌段共聚物对纳米粒的影响。其中2 000 Da的mPEG 与38 000、18 000、12 000 Da 三种分子量的PLGA 结合，组成分别为5%、10%、15%三种种类的mPEG-PLGA。

2.2.2 mPEG-PLGA 浓度的选择配制5、10、15、20、25 和30 mg/mL 不同浓度的嵌段共聚物。考察共聚物不同浓度对纳米粒的影响。

2.2.3 油水两相比例的选择将5 mL 油相分散于5、10、15、20 和25 mL 不同体积的水相中，在1∶1、1∶2、1∶3、1∶4 和1∶5 的油水两相比例下，考察油水两相体积比对纳米粒的影响。

2.2.4 乳化剂的选择分别使用乳化剂Tween 80，PVA 和Poloxamer 188，考察不同乳化剂对纳米粒的影响。

2.2.5 乳化剂浓度的选择确定乳化剂后，配制0.05%、0.10%、0.50%、1.00%和1.5%五种不同浓度的乳化剂，考察乳化剂浓度对纳米粒的影响。

2.2.6 磁力搅拌速率的选择使用400、600、800、1 000 和1 200 rpm 不同的搅拌速率，考察搅拌速率对纳米粒的影响。

2.2.7 离心过滤方式的选择采用不同的过滤离心方式制备空白纳米粒：（1）不过滤膜，10 000 rpm离心30 min，舍弃上清液，加水重新混悬纳米粒；（2）不过滤膜，14 000 rpm 离心20 min，舍弃上清液，加水重新混悬纳米粒；（3）过0.22 μm 孔径滤膜，10 000 rpm 离心30 min，舍弃上清液，加水重新混悬纳米粒。考察三种过滤离心方式对纳米粒的影响。

2.3 CCD-RSM 优化处方方法

以单因素考察确定结果为基础，选择对mPEGPLGA 纳米粒制备影响较大且需进一步考察的三个因素作为考察对象，即共聚物浓度（A）、乳化剂浓度（B）和磁力搅拌速率（C）。由中心点、析因设计点、极值点三个方面进行设计，五水平（-1.682、-1、0、1、+1.682），以size（Y1）与PDI（Y2）为响应参数，各因素以及水平值标准化值根据实际情况做出调整，进行CCD-RSM 实验，并记录数据，使用design-expert 11 软件进行数据处理。

3 结果与讨论

3.1 单因素影响因素实验

3.1.1 mPEG-PLGA 分子量和浓度的选择以10%含量的mPEG 作为载体，纳米粒的size 和PDI 均较小（图1）。当共聚物中PEG 的比例不断减少，size关系为：10% PEG-PLGA＜15% PEG-PLGA＜5% PEGPLGA。同时，10% PEG-PLGA 的图谱中无拖尾现象。但是5%和15% PEG-PLGA 样品在1 000 nm 以上有1%左右的峰值，可能是溶剂中的杂质所致（见图2）。因此后续使用mPEG 含量为5%的mPEG-PLGA 嵌段共聚物进行实验。

图1 共聚物种类对纳米粒的影响

图2 存在余峰代表性图

此外，当共聚物浓度不断增加，size 随之增加，但PDI 值出现先增大后减小的现象（图3），故共聚物浓度对size 与PDI 值影响明显，优先满足size 值，为便于研究，选择合适浓度范围，故选择5 mg/mL至15 mg/mL 为后续优化实验时投料的共聚物浓度。

图3 共聚物浓度对纳米粒的影响

3.1.2 油水两相比例的选择随着油水比例减小，size 逐渐增加，PDI 值变化不大（图4）。因此，选取最小size 值下的油水比例1∶2 作为最佳油水两相比例。此外制备过程中发现，把油相一滴一滴加入到水相中，乳化效果更好。

图4 油水两相比例对纳米粒的影响

3.1.3 不同乳化剂和浓度的选择三种不同乳化剂对size 和PDI 影响几乎相同（图5）。但Poloxamer 188生物安全性更好［6］，因此选择其作为制备纳米粒的乳化剂。当Poloxamer 188 浓度从0.05%逐渐增加到1.5%时，size 从62.92 nm 逐渐增加到95.40 nm（图6）。表明随着乳化剂浓度逐渐增加，size 随之增大，但1%乳化剂浓度下size 突然降低，乳化剂浓度对纳米粒影响较大，因此乳化剂是形成纳米粒的重要因素之一［7］。当浓度超过0.5%，PDI 持续增加，所以确定乳化剂从0.05%至0.5%浓度为范围，进行后续优化实验考察。

图5 乳化剂种类对纳米粒的影响

图6 乳化剂浓度对纳米粒的影响

3.1.4 磁力搅拌速率的选择搅拌速率对纳米粒的形成具有影响［8］。速率从400 rpm 增加到800 rpm时，size 和PDI 与转速呈负相关（图7）。当转速为400 rpm 时，size 较大，PDI 稍高，可能由于转速过低，磁力搅拌不均所致。实验时延长磁力搅拌时间1～2 h，搅拌更加均匀，PDI 值更小些。而转速为1 200 rpm 时，size 最小，但PDI 值在高于800 rpm后呈现增加趋势，所以转速过高过低均不利于纳米粒的形成。磁力搅拌速率对纳米粒的形成影响较大，故选择600 rpm 至1 000 rpm 速率范围进一步进行优化实验。

图7 磁力搅拌转速对纳米粒的影响

3.1.5 离心过滤方式的选择采用先过0.22 μm滤膜，再10 000 rpm 离心30 min，弃掉上清液，采用第三种方法制备的纳米粒size 和PDI 更合适（图8）。

图8 过滤离心方式对纳米粒影响

3.2 CCD-RSM 优化处方结果

3.2.1 实验结果模拟拟合A、B 和C 响应因素对size 以及PDI 的考察，实验结果见表1。依据前述方法以Y1、Y2为因变量，A、B、C 为自变量，对实验数据构建二次多项式回归方程拟合。方程如下：

表1 CCD-RSM实验结果

方差分析结果见表2。根据方程中相关系数r值以及P值可知，方程拟合度较高，模型误差较小，可以较好地反映出效应值与影响因素之间的关系。方差分析结果显示，Y1模型P=0.019 6（P＜0.05），说明此模型差异有统计学意义，Y2模型P=0.002 7（P＜0.01），相比Y1模型，Y2模型显著差异更强。评价指标Y1所属方程中A2与B2对Y1有显著影响，且A2影响更强，效果极显著；在评价指标所属Y2方程中B与B2对Y2有显著影响。

表2 方差分析结果

3.2.2 三维效应面图与最优处方预测size（Y1）、PDI（Y2）作为纳米粒的重要评价指标，对纳米粒的质量影响较大，故利用该模型构建效应面三维图进行最优制备工艺预测。根据拟合方程绘制三维效应面图（图9）。结合最优处方要求与软件预测结果，确定该空白纳米粒制备工艺条件为：共聚物浓度10.41 mg/mL、乳化剂浓度0.21%、磁力搅拌速率870 rpm。

图9 三因素对size与PDI影响的三维效应面图

3.3 最优处方工艺验证

对优选的处方及工艺的可靠性及稳定性进行验证，按CCD-RSM 筛选出的结果制备3 批空白纳米粒，结果所得纳米粒size 为90.74 nm±2.9 nm、PDI为0.22±0.08。纳米粒size 和PDI 均较小，表明该工艺制备方法可行，效果良好。

4 讨论

本实验采用乳化挥发法，操作简单，方法的重现性较好，可放大至工业化生产。相较于载药纳米粒，空白纳米粒常被用来证明载药纳米粒的治疗作用，因此具有良好size 和生物安全性的空白纳米粒更应深入研究［9］。用载药纳米粒的工艺制备空白纳米粒，仅可作为参考，因药物的溶解性，药物、载体、有机溶剂之间的强弱作用关系等，并不是直接按照相同工艺制备所得的空白纳米粒size 和PDI 都较好［10］。Poloxamer 188 的浓度越低，乳化效果越好。有报道称，乳化剂用量不足可致使纳米聚沉；随着乳化剂用量增加，size 会越来越小，但浓度过高时，乳化剂对纳米粒的稳定性有影响［11］，与本研究结果相吻合。本研究制备了mPEG-PLGA 空白纳米粒，运用单因素实验及星点设计-效应面法优化筛选出最优处方和工艺，制备的空白纳米粒size 和PDI 均较小，该处方及工艺可行，为下一步研究提供有益参考。