改良大鼠脊髓缺血再灌注损伤模型的再评价及应用研究

张志琴，王振飞，何大伟，陆轲，郝彦明，李翀

1.昆山市第一人民医院生物样本库，江苏 昆山 215316；2.徐州市中心医院骨科，江苏 徐州 221009；3.昆山市第一人民医院骨科，江苏 昆山 215316

胸腹主动脉瘤术后有较高截瘫发生率[1-2]。由于术中临时阻断了动脉血供造成脊髓缺血，研究普遍认为脊髓缺血缺氧在脊髓继发性损伤中具有重要作用。对于脊髓损伤病理机制研究及治疗方法的改进均有赖于成功制作动物模型。目前，脊髓损伤模型种类较多，包括机械性、血管性、光化学性损伤等[3]，其中缺血损伤又包括夹闭腹主动脉法、阻断腰动脉法、气囊栓塞法等。有学者认为，大鼠脊髓的血供节段性不强，应用大鼠制作脊髓缺血再灌注损伤(spinal cord ischemia-reperfusion injury，SCII)模型并不十分理想。但较多文献报道，脊髓缺血损伤模型具有可操作性强、行为学稳定、病理改变一致等优点，而且大鼠脊髓血供与人相似[4]。在制作大鼠SCII 模型时，大多学者选取左肾动脉下夹闭腹主动脉[5-6]。据报道，该模型只能造成第三腰椎以下范围缺血，并不能造成高位脊髓缺血。有学者对该模型进行了改良，通过夹闭右肾动脉上腹主动脉近心端制作SCII，该模型可以造成T13节段以下脊髓缺血，但缺血程度、时限及可以造成的病理损伤尚没有一致的认识，因此该模型的评价显得十分重要。本研究拟建立并评价一种改良大鼠脊髓缺血再灌注损伤模型，为脊髓缺血再灌注损伤相关研究提供可靠、稳定的动物模型。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 实验动物选用清洁级雄性 SD 大鼠36 只，体质量300～400 g，由中国科学院上海实验动物中心(斯莱克实验动物有限公司)提供。实验经昆山市第一人民医院动物伦理委员会批准实施。随机分为7 组，A1、A2 每组3 只，B1、B2、B3、B4、B5 每组6 只。A1 组不结扎腹主动脉仅行单纯手术操作，心脏灌注Microfil(Flow Tech，USA)。A2组结扎腹主动脉后心脏灌注Microfil。B1组为空白对照组，B2、B3 组夹闭腹主动脉60 min 后开放腹主动脉分别再灌注24 h、48 h；B4、B5 组夹闭腹主动脉90 min后开放腹主动脉分别再灌注24 h、48 h；观察大鼠下肢功能改变并取脊髓做病理检测。

1.2 改良缺血再灌注模型的建立及方法 模型制作参考既往文献介绍的方法，即选择性夹闭大鼠右肾动脉上极腹主动脉近心端造成脊髓缺血。2.5%戊巴比妥钠麻醉大鼠，消毒铺巾，术中予以体温检测，维持大鼠体温恒定。取腹部正中切口，打开腹膜，暴露腹主动脉，使用50 g 夹闭力的动脉夹夹闭腹主动脉。A1 组动物麻醉后打开胸腔及腹腔，剪断下腔静脉，进行体循环灌注，应用含有肝素钠的生理盐水左心室灌流约300 mL至肝脏变白，下腔静脉流出清凉液体。然后应用4%的多聚甲醛灌流约250 mL 进行组织内固定，大鼠表现为全身肌肉痉挛，鼠尾翘起，至大鼠全身僵硬。将配好的Microfil 20 mL 加压注射至左心室，灌注成功后明显可见肝脏以及腹腔肠系膜毛细血管内充盈黄色造影剂。待Microfil 凝固后取出T11～L6脊髓组织，置于4%的多聚甲醛中保存。A2 组在灌注Microfil前夹闭腹主动脉，其余步骤同A1 组。同步辐射螺旋显微CT于中国科学院上海应用物理研究所进行。B1 组为空白对照组，打开腹腔后随即关闭腹腔。B2、B3 组夹闭腹主动脉 60 min 再灌注24 h、48 h。动物苏醒后表现双下肢完全瘫痪，针刺下肢有反应，但肢体不能活动者列入研究对象。术后每天给予庆大霉素8 万单位肌肉注射预防感染。再灌注24 h、48 h后2.5%戊巴比妥钠麻醉大鼠，肝素钠生理盐水及4%多聚甲醛心脏灌流，取出脊髓后置于4%多聚甲醛中保存。B4、B5 组夹闭腹主动脉90 min 后再灌注24 h、48 h。其余手术操作同B2、B3组。

1.3 神经行为学评价 采用BBB 评分于术后6 h、12 h、24 h和48 h对B组大鼠进行行为学评估，包括0～21级，完全功能缺失为0分，完全正常鼠为21分，评价的内容主要包括大鼠后肢的运动躯干位置及稳定性步态协调性爪的置放足趾间隙以及尾的位置等。

1.4 组织病理学检测 4%多聚甲醛浸没组织，梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋，依次修块切片摊片烤片后保存备用。HE 染色：切片脱蜡至水，苏木素染色3～8 min，流水稍冲洗，1%盐酸酒精溶液分化30 s(观察分化效果)，流水稍冲洗；1%氨水溶液返蓝30 s，流水稍冲洗；镜检着色满意后入伊红染液染色1～3 min；梯度酒精各5 min，二甲苯，中性树脂封片。尼氏染色：切片脱蜡至水，入0.5%甲苯胺蓝染液染3 min，水洗，用95%酒精分化，显微镜下控制，烤干，中性树胶封片。

1.5 统计学方法 应用SPSS22.0 统计软件进行数据分析。计量资料符合正态分布，以均数±标准差()表示，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，组间比较采用SNK 法。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 脊髓动脉血供 L1节段脊髓动脉分布情况见图1。A1 组水平面可见位于腹侧面的脊髓前动脉，和成对的脊髓后动脉，正常脊髓动脉系统血供丰富；A2 组水平面显示当夹闭右肾动脉上腹主动脉近心端时，两条脊髓后动脉被完全阻断。从侧面观机与上面观对比可见腹主动脉夹闭前后L1节段的脊髓后动脉被阻断，仅脊髓前动脉未被阻断。通过查阅文献，了解到脊髓前动脉来源于椎动脉的颅内分支，通过阻断腹主动脉无法阻断该动脉。通过血管铸型CT 三维重建，显示夹闭腹主动脉后，自L1以下的脊髓大部分血流被阻断。

图1 夹闭腹主动脉前后的节段脊髓血管矢状位及水平位三维重建图像

2.2 各组大鼠的BBB 评分比较 如表1 所示，与 B1 组比较，B2、B3 组 BBB 评分明显降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)，B3 组比 B2 组有升高趋势，6 h、12 h 两个时间点差异具有统计学意义(P＜0.05)；B4、B5 组同 B1 组比较，BBB 评分明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)；同 B2、B3 组同时间点比较差异具有统计学意义(P＜0.05)，B5 组评分较 B4 有升高趋势。

表1 各组大鼠的BBB评分比较()

表1 各组大鼠的BBB评分比较()

注：与6 h组比较，aP＜0.01，bP＜0.05；与12 h组比较，cP＜0.01，dP＜0.05；与24 h组比较，eP＜0.01。

组别60 min 90 min B1组B2组B3组B4组B5组F值t值P值6 h 21.00±0 4.02±0.54 4.14±0.35 12 h 21.00±0 10.10±0.71a 10.76±0.92a 24 h 21.00±0 14.02±0.76c 14.40±0.52c 48 h 21.00±0-17.00±0.71e 6 h 21.00±0 12 h 21.00±0 24 h 21.00±0 48 h 21.00±0--------------5.06±0.34e-----47.29 0.000 1 696.60-0.000 1 82.02-0.000 1 54.21-0.000 1 5.657 0.004 8 1.84±0.34 2.00±0.35 1 526-0.000 1 1.90±0.34a 3.14±0.33b 1 532-0.000 1 3.90±0.34c 4.20±0.36d 1 183-0.000 1

2.3 病理检测 如图2所示，B1组神经元细胞形态多样化，胞体较大，细胞质呈嗜酸性粉染，细胞核大呈嗜碱性蓝染，核仁明显。神经胶质细胞呈小圆形或椭圆形，数量较多，细胞较小，细胞质淡粉染，细胞核小而深染，核仁不明显，细胞间质呈粉色淡染。再灌注24 h、48 h时后可见脊髓组织出现神经细胞肿胀、嗜酸性增加。随缺血时间及阻断时间的延长，其损伤程度逐渐加重。如图3 所示，尼氏体受染后呈块状或颗粒状，核周围尼氏体颗粒较大，近边缘处较小而细长。在神经元受损时，尼氏体的数量可减少甚至消失，因此根据尼氏体受染情况和数量差异，可以判断神经元受损程度。对照组、B1组脊髓尼氏染色神经元细胞形态基本正常。缺血60 min再灌注24 h、48 h，缺血90 min再灌注24 h、48 h组脊髓病理改变逐渐加重，且以脊髓前灰质受损更明显。B2、B3 组脊髓组织病理显示运动神经元肿胀，核仁尚清楚、深染，中央性尼氏小体肿胀，排列松散；B4、B5 部分尼氏小体溶解或消失。

图2 各组大鼠缺血前后的脊髓组织HE染色结果(100×)

图3 各组大鼠缺血前后的脊髓组织尼氏染色结果(100×)

3 讨论

自从ZIVIN等[7]以夹闭兔肾动脉下腹主动脉建立脊髓缺血再灌注损伤模型以来，各种改良的模型不断涌现。伍亚民等[8]通过选择性阻断家兔腰动脉模拟出不同程度的损伤，避免了夹闭腹主动脉而造成的下肢及腹腔脏器的缺血损伤。CHENG 等[9]由家兔右股动脉插入Swan-Ganz 球囊导管至腹主动脉，并在动脉造影X射线监视下插至肾动脉起始部，通过充气和排气复制脊髓缺血再灌注模型。SCII模型逐渐引入狗、大鼠等试验动物[10-11]。大鼠因接近人类脊髓血供情况，而且价格适宜，易于饲养及管理而被广泛用于实验研究。有学者应用2F Fogarty带囊导管插入鼠脊髓胸主动脉造成脊髓缺血。另有有较多研究应用夹闭大鼠左肾动脉下腹主动脉造成脊髓缺血，均获得良好效果。然而，由于夹闭左肾动脉下腹主动脉仅平脊髓L4～5位置，造成脊髓缺血范围较局限，所以该模型并不是一个十分理想的SCII模型。因此，有学者对该模型进行了改良，夹闭右肾动脉上腹主动脉近心端以造成脊髓更大范围的缺血损伤[12]。目前，改良模型在造成脊髓缺血前后的血供情况及缺血后脊髓组织病理改变等资料仍然缺乏。该研究应用脊髓血管铸型三维重建技术及脊髓组织病理观察重新评估该模型的可靠性及稳定性。

脊髓动脉同步辐射CT 三维重建图像显示了夹闭腹主动脉前后T13节段以下脊髓动脉血供分布情况，为夹闭腹主动脉后脊髓血供分布提供了客观依据。通过查阅文献资料我们了解到，未被阻断的动脉分支来源于椎动脉的颅内分支，向下走行至腰膨大并逐渐变细，证实了有学者认为的大鼠脊髓血供节段性不强的观点。同时也证实了该模型能够阻断T13以下节段脊髓大部分动脉供应。BBB评分显示，随着缺血时间的延长，BBB评分呈下降趋势，表明缺血时间越长，脊髓损伤越重。再灌注48 h较24 h评分有升高趋势，显示再灌注24 h 后脊髓损伤有逐渐恢复的趋势。脊髓尼氏染色能较好地反映灰质的病理改变情况，神经损伤表现为神经元尼氏体淡染或消失。缺血90 min 组较缺血60 min同时间点神经元损伤数量明显增多，提示神经损伤严重程度与缺血时间呈正相关。HE 染色结果同尼氏染色一致。有文献报道，对主动脉阻断的手术患者进行死亡率回顾分析，结果显示神经功能受损的严重程度与主动脉阻断时间呈正相关[13]。

综合分析脊髓动脉三维CT 重建图像、大鼠行为学评分、脊髓组织病理结果，该模型成功造成了脊髓T13以下节段缺血损伤，而且行为学及病理学改变稳定，神经损伤程度与缺血时限有明显相关性，即不同的缺血时间造成了不同程度的损伤。该模型也有不足之处：夹闭更高位置的腹主动脉造成了腹腔脏器更大范围的缺血损伤，增大了大鼠术后死亡率。该模型也具有更多优点：操作简单、实验动物易于获得、易于管理、脊髓血管解剖接近人等。综上，该改良模型简易可控，具有推广价值。