兰香草中总黄酮和木犀草素提取工艺优化及其含量动态分析

郭 庆，陈美安，张欣影，李宗泽，黄星海

(广西中医药大学 药学院，广西 南宁 530001)

兰香草，为马鞭草科莸属植物兰香草(Caryopterisincana(Thunb.) Miq.)的全草或带根全草[1]，其别名较多，比较常见的有婆绒花、石母草、段菊等。兰香草药用资源丰富，易采集，我国有13种、2变种、1变型，主要分布于广西、广东、湖南、江西等地，其味辛，气香，性微温，具有疏风解表、祛寒除湿、散瘀止痛之功效，可用于治疗风寒感冒、慢性支气管炎、皮肤瘙痒、风湿痹痛、跌打肿痛、外伤出血等症[2-4]。现代药理研究表明兰香草有抗氧化、抗炎、抗菌、止咳、祛痰等作用[5-8]，兰香草全草中含有精油、生物碱、黄酮、酚酸、氨基酸、甾体、有机酸、鞣质等成分，其中黄酮类成分含量最多[9-10]，具有良好的药用价值。课题组前期从兰香草乙酸乙酯部位中分离出若干个黄酮类化合物，其中1个鉴定为木犀草素[11]。目前，关于兰香草的化学成分、提取工艺、质量分析等研究报道甚少，且尚未见其黄酮类成分含量动态积累研究的报道，亦无统一种植和采收规范标准，难以保证市场上兰香草药材的质量。因此，本文采用正交试验优化提取兰香草中总黄酮和木犀草素的工艺，为其提取工艺研究奠定一定基础。同时，探讨兰香草中总黄酮和木犀草素含量在不同采收期的动态变化趋势，明确其含量与采收时间之间的关系，为指导兰香草药材的合理采收，后续药理活性、质量分析及药用价值的开发利用等方面奠定了科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

12个不同月份兰香草药材，经广西中医药大学中药鉴定教研室朱意麟药师鉴定为马鞭草科莸属植物兰香草(Caryopterisincana(Thunb.) Miq.)的干燥全草，阴干，粉碎成粗粉，备用。

表1 兰香草药材信息

芦丁对照品(规格：20 mg/支，供含量测定用，纯度：98%，批号：100080-201811，中国药品生物制品检定所)；木犀草素对照品(规格：20 mg/支，供含量测定用，纯度：98%，批号：111520-201605，中国药品生物制品检定所)。乙腈、甲醇均为色谱纯(美国Fisher公司)；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

Agilent 1260高效液相色谱仪(美国安捷伦科技公司)；JADE-PAK ODS-AQ C18色谱柱(5μm，250 mm×4.6 mm，太玮科技)；BP211D电子分析天平(德国赛多利斯公司)；TGL-16B高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；KQ5200B 型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；SHB-III循环水式多样真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；UPC-11-10T实验室超纯水器(四川优谱超纯科技有限公司/成都超纯科技有限公司)。

1.2 总黄酮含量测定

1.2.1 溶液制备 取干燥至恒重的芦丁对照品约3 mg，精密称定，置于10 mL的容量瓶中，加甲醇溶解定容，配制成浓度为0.296 0 mg/mL的芦丁对照品溶液。取兰香草粉末约1 g，精密称定，称重，按一定条件超声提取，放冷，用提取溶剂补足重量，摇匀，定量过滤，定容至100 mL容量瓶中，即得供试品溶液Ⅰ。

1.2.2 线性关系考察 分别精密吸取“1.2.1”项下芦丁对照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置于25 mL容量瓶中，精密加入5%亚硝酸钠溶液1.0 mL，充分振摇后放置5 min，精密加入10%硝酸铝溶液1.0 mL，充分振摇后放置5 min，精密加入4%氢氧化钠溶液10.0 mL，用甲醇定容至刻度，充分振摇后放置15 min。以甲醇作空白，在500 nm测定相应溶液吸光度(A)。以芦丁对照品浓度(C，mg/mL)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，绘制标准曲线。求得芦丁的回归方程为：Y=12.874 9X-0.006 189 98(r=0.999 9)。结果表明对照品溶液在0～0.059 2 mg/mL浓度范围内线性关系良好。芦丁标准曲线见图1。

图1 芦丁对照品标准曲线

1.3 木犀草素含量测定

1.3.1 溶液制备 取干燥至恒重的木犀草素约3 mg，精密称定，置于25 mL的容量瓶中，加甲醇溶解定容至刻度，配制成浓度为120μg/mL的木犀草素对照品溶液。取供试品溶液Ⅰ40 mL，浓缩至干，定容至2 mL容量瓶中，即得供试品溶液Ⅱ。

1.3.2 色谱条件 色谱柱：JADE-PAK ODS-AQ 柱(5μm，250 mm×4.6 mm)；流动相：甲醇-0.2%磷酸(55∶45)；检测波长：350 nm；流速：1 mL/min；柱温：25 ℃；进样量：10μL。木犀草素的色谱峰与相邻色谱峰之间分离度均大于1.5，拖尾因子均在0.90～1.05之间；理论塔板数按木犀草素计均大于10 000，满足定量要求。色谱见图2和图3。

图 2 木犀草素对照品高效液相色谱

图 3 兰香草供试品高效液相色谱

1.3.3 线性关系考察 精密吸取“1.2.1”项下木犀草素对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，按“1.3.2”项下色谱条件，分别取上述6个不同浓度的对照溶液注入高效液相色谱仪，测定峰面积。以木犀草素对照品溶液进样浓度(C，μg/mL)为横坐标，色谱峰峰面积(A)为纵坐标，绘制标准工作曲线，求得木犀草素的回归方程为：Y=55.461 624 7X-30.948 509(r=0.999 9)。结果表明对照品溶液在6～60μg/mL浓度范围内线性关系良好。木犀草素标准曲线见图4。

图4 木犀草素对照品标准曲线

1.4 兰香草总黄酮和木犀草素提取工艺优化

1.4.1 单因素实验 称取同一批次编号C6兰香草粉末，每份约1 g，精密称定，固定其他因素不变的条件下，分别考察提取溶剂(30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇、乙醇、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、90%甲醇、甲醇)，料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50)，提取时间(30、60、90、120 min)和提取次数(1次、2次、3次)等四个因素对兰香草提取总黄酮含量和木犀草素含量的影响，以筛选出各因素最优提取条件。

1.4.2 正交实验 称取同一批次编号C6兰香草粉末，每份约 1 g，精密称定，根据单因素实验结果，以兰香草中总黄酮含量和木犀草素含量的综合评分为考察指标，选择乙醇浓度(A)、物料比(B)、提取时间(C)、提取次数(D)作为考察因素，采用L9(34)正交实验设计进行实验，因素水平见表2。

表2 L9(34)正交实验设计

1.5 兰香草总黄酮和木犀草素含量动态测定

分别称取12个不同月份的兰香草粉末，各3份，每份约1 g，精密称定，按“1.2.1”项下和“1.3.1”项下方法平行制备供试品溶液。精密吸取供试品溶液Ⅰ2.0 mL，置于25 mL容量瓶中，按“1.2.2”项下所述方法进行测定，计算总黄酮的含量及RSD值；精密吸取供试品溶液Ⅱ10μL，按“1.3.2”项下色谱条件进样检测，记录峰面积，计算木犀草素的含量及RSD值。

总黄酮的含量(mg/g)= (C1×V1×N1)/m，式中，C1为样品中总黄酮的浓度，mg/mL；V1为测定时定容的体积，mL；N1为稀释倍数；m为生药材量。

木犀草素的含量(μg/g)= (C2×V2×N2)/m，式中，C2为样品中木犀草素的浓度，mg/mL；V2为测定时定容的体积，mL；N2为稀释倍数；m为生药材量。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果与分析

2.1.1 提取溶剂的影响 结果见图5和图6，可知乙醇和甲醇在相同浓度的条件下，以不同浓度乙醇的提取量相对较高；其中，在不同乙醇浓度中，随着乙醇浓度的增加，总黄酮和木犀草素提取量不断增大，当乙醇浓度增加至70%时提取量达到最高值，此时再继续增加乙醇浓度，提取量反而降低。因此采用70%乙醇作为提取溶剂。

图5 提取溶剂对总黄酮含量的影响

图6 提取溶剂对木犀草素含量的影响

2.1.2 料液比的影响 结果见图7和图8，料液比按照10倍量不断递增考察，发现随着溶剂量的增加，总黄酮和木犀草素提取量先升高，当料液比为1∶40 g/mL时达到最高值后再降低。可能原因是增加溶剂量过多，导致其他成分溶出量增加，反而影响了指标成分的溶出。因此采用料液比为1∶40最适宜。

图7 料液比对总黄酮含量的影响

图8 料液比对木犀草素含量的影响

2.1.3 提取时间的影响 结果见图9和图10，当提取时间为60 min时，总黄酮和木犀草素提取量最高，继续延长提取时间，反而有稍有降低，趋于平稳。在60 min左右，溶解药材组织细胞内外指标成分的浓度达到动态平衡，因此采用提取时间为60 min最适宜。

图9 提取时间对总黄酮含量的影响

图10 提取时间对木犀草素含量的影响

2.1.4 提取次数的影响 结果见图11和图12，当提取次数为2次时，有利于总黄酮和木犀草素的溶出，提取量最高。因此采用提取次数为2次最适宜。

图11 提取次数对总黄酮含量的影响

图12 提取次数对木犀草素含量的影响

2.2 正交实验结果与分析

正交实验结果及方差分析见表3和表4。由表3可知，R值越大，表明该因素的水平变动对试验结果的影响越大，四因素对兰香草总黄酮和木犀草素提取影响的顺序为乙醇浓度(A)>提取次数(D)>提取时间(C)>料液比(B)。由表4可知，四个因素对兰香草总黄酮和木犀草素含量的提取均无显著性差异(P>0.05)。综合考虑最佳提取工艺条件组合为：A2B2C2D2，即乙醇浓度为70%，料液比为1∶40，提取时间为60 min，提取次数为2次。

表3 正交实验结果

表4 正交试验方差分析结果

2.3 验证试验

为进一步考察提取工艺的稳定可靠，称取同一批次编号C6兰香草粉末3份，每份约1 g，精密称定，根据“2.2”项下正交实验优化得到的最佳提取工艺进行验证试验。此工艺条件下总黄酮和木犀草素含量，结果见表5。

表5 正交试验验证结果

2.4 兰香草总黄酮和木犀草素含量动态测定结果与分析

结果见表6、图13和图14，不同采收期兰香草药材中总黄酮及木犀草素含量不同，两者总体变化趋势均随着药材生长不断递增，1月和2月含量最低，9月达到峰值(总黄酮平均含量为96.95 mg/g，RSD为0.50%；木犀草素平均含量为226.48μg/g，RSD为1.05%)，之后逐渐减低。其中，总黄酮和木犀草素含量1月与2月无显著性差异(P>0.05)，但与其他采收时间差异显著(P<0.01)；总黄酮含量9月与其他采收时间差异显著(P<0.01)；木犀草素含量8月与9月无显著性差异(P>0.05)，但与其他采收时间差异显著(P<0.01)。

表6 不同采收期兰香草中总黄酮和木犀草素含量测定结果

图13 不同采收期兰香草中总黄酮含量

图14 不同采收期兰香草中木犀草素含量

3 讨论

兰香草为壮族民间常用草药，目前尚未明确兰香草的药效成分，但兰香草中含有丰富的黄酮类成分，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、镇痛、降血糖、心血管系统保护及防治阿尔茨海默病等药理活性[12-16]。木犀草素是一种天然黄酮类化合物，存在于许多中药中，课题组前期从兰香草中分离鉴定出来木犀草素，在兰香草中含量比较高，同样具有很好的药理活性，如抗过敏、抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、心脏保护和神经保护等[17-21]，临床主要用于治疗肝炎、心血管疾病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、降尿酸和止咳化痰等。因此，本实验选择总黄酮和木犀草素作为评价兰香草药材质量的重要指标之一，建立其含量测定方法，优化提取工艺，并分析其含量动态积累变化趋势，以指导该药材制定合理采收时间。

在含量测定方法建立中，采用紫外-可见分光光度法总黄酮含量测定，以芦丁为对照品，NaNO2-Al(NO3)3-NaOH作为显色系统，使芦丁的邻二酚羟基形成络合物而显色，在500 nm处有最大吸收。同时，采用高效液相色谱法木犀草素含量测定，并对流动相和检测波长这两个色谱条件进行了摸索。流动相曾考察了乙腈-水(28∶72)、甲醇-水(45∶55)、乙腈-0.2%磷酸溶液(28∶72)、甲醇-0.2%磷酸溶液(45∶55)，结果表明以甲醇-0.2%磷酸溶液(45∶55)为流动相时，图谱基线平缓，木犀草素的响应值好，峰形好，与相邻色谱峰分离度好，理论塔板数、拖尾因子等均符合要求。检测波长的选择，采用二极管阵列检测器在波长为190～400 nm范围内进行扫描，发现木犀草素在254 nm和350 nm处有最大紫外吸收，因此本实验根据扫描结果结合文献报道考察了254 nm、280 nm、350 nm、360 nm这4个不同波长图谱情况，结果表明在350 nm处测定时，木犀草素有较强吸收，且干扰甚少，图谱特征性也很强。另外，进行了总黄酮和木犀草素含量测定的方法学考察，结果表明本测定方法仪器精密度好，操作简便、稳定可行，可作为兰香草中总黄酮和木犀草素含量测定的方法。

提取工艺优化考察，根据此单因素试验结果，选择乙醇浓度、料液比、提取时间和提取次数作为考察超声提取的四个影响因素，采用L9(34)正交实验优化提取兰香草总黄酮和木犀草素的最佳工艺，结果显示最佳超声提取工艺条件为：乙醇浓度为70%，料液比为1∶40，提取时间为60 min，提取次数为2次。正交实验结果刚好跟单因素考察结果是一致的，提示该超声提取工艺简单合理、提取率高、稳定性好，为兰香草工业化生产奠定了实验基础。

兰香草的药用部位是全草或带根全草，1月和2月为休眠期，植株枯萎倒塌，此时总黄酮和木犀草素含量是最低的。3月初兰香草种子萌芽展叶，植株非常小，总黄酮和木犀草素含量低。随着月份增加，4-5月不断抽生新枝展叶生长，植株逐渐长高，总黄酮和木犀草素含量有所增加。6-8月为植株营养生长旺盛期，枝条迅速抽长，株高和冠幅增长也非常快，总黄酮和木犀草素含量增加幅度很大。8月底进入生殖生长期，9月底植株达到最大生长高度，总黄酮和木犀草素含量达到最大值，且木犀草素含量在8月与9月无显著性差异(P>0.05)。由此可知，在营养生长旺盛和生殖生长期，阳光和雨水充足，温度适宜，植株生长迅速，利于总黄酮和木犀草素的生物合成。10月开始，天气逐渐转凉，总黄酮和木犀草素含量逐渐降低，12月植株地上部分枯萎落叶，进入休眠期，其含量大幅度降低。因此，本实验认为广西宜州兰香草药材的采收，以总黄酮含量为评价指标时，9月采收最佳；以木犀草素含量为评价指标时，8月和9月采收最佳。