广金钱草药材的UPLC特征图谱及其质量评价

贾小舟，杨小龙，梁月仪，潘晓君，李振雨，林碧珊，陈向东，魏 梅，孙冬梅*

(1.广东一方制药有限公司，广东 佛山 528244；2.广州中医药大学，广东 广州 510400；3.国药集团广东环球制药有限公司，广东 佛山 528305)

广金钱草来源于豆科植物广金钱草Desmodiumstyracifolium(Osb.)Merr.的干燥地上部分[1]，采收季节为夏季、秋季，去杂晒干。广金钱草是我国常用的传统中药之一，气微香，味甘、性凉，归于肝、肾、膀胱经[2]，其药用部位为干燥地上部分。现代药理研究表明，广金钱草具有清热除湿、利尿通淋、排石等作用，被广泛应用于医治肾、肝、胆结石，尿路感染、消炎及改善心血管等病症[3-4]。广金钱草含有黄酮、生物碱、多糖等多种成分，其中黄酮类化合物为广金钱草的主要组成成分，具有多种药理作用，如降血压、利尿、利胆及溶解或预防泌尿系结石等。广金钱草中的芹菜素黄酮碳苷类成分主要是夏佛塔苷及其同分异构体异夏佛塔苷，在抗炎、清热祛湿、利尿通淋等方面具有重要活性作用[5]。因夏佛塔苷预防肾结石效果显著，该化合物的葡萄糖苷或阿拉伯糖苷的注射剂或口服剂型已在日本获得专利授权。本实验通过建立广金钱草特征图谱检测方法，结合特征图谱相似度分析、化学成分聚类分析，综合特征图谱及多指标含量测定，对市售药材广金钱草的质量情况进行评价。

1 仪器与试药

1.1 仪器

UPLC(Waters H-Class，USA)；美国赛默飞四极杆-静电轨道阱高分辨质谱仪(UHPLC-Q-Exactive Obitriap MS，Thermos)；UPLC CORTECS T3色谱柱(2.1 mm×150 mm，1.6 μm，Waters)；百万分之一天平(XP 26，瑞士梅特勒多)；数显超声波清洗器(KQ500DE，昆山市超声仪器有限公司)；恒温水浴锅(HWS28，上海一恒科技有限公司)；超纯水系统(Milli-QDirect 8，Merck KGAA)。

1.2 试剂与试药

甲醇、乙腈(默克股份有限公司)，磷酸、甲酸(天津市科密欧化学试剂有限公司)为色谱纯，其余试剂皆为分析纯。夏佛塔苷(批号：111912-201302，NIFDC)；异荭草苷(批号：111974-201401，NIFDC)；异夏佛塔苷(批号：DST170323-019，Desite)；异牡荆苷(批号：DST170214-054，Desite)；广金钱草对照药材(批号：121248-201104，NIFDC)。18批广金钱草药材经广东一方制药有限公司魏梅主任药师鉴定其来源为豆科植物广金钱草Desmodiumstyracifolium(Osb.)Merr.的干燥地上部分，见表1。

表1 18批广金钱草药材来源

2 方法与结果

2.1 色谱条件

UPLC CORTECS T3色谱柱(2.1 mm×150 mm，1.6 μm，Waters)；乙腈为流动相A，0.1%磷酸(质谱分析为0.1%甲酸溶液)为流动相B，设定梯度洗脱程序(0～10 min，15%A；10～11 min，15→16%A；11～15 min，16%A)；柱温：30 ℃；流速设置为0.2 mL/min；检测波长设置为340 nm。

2.2 质谱条件

高分辨质谱为电喷雾离子源(HESI)，喷雾电压设置为3.80 kV，辅助气温设置为350 ℃，离子传输管温度设置为350 ℃；鞘气流速设置为35 psi；辅助气流速设置为10 psi；离子模式设置正、负模式，并分别扫描采集，扫描质量范围为120～1 000 Da；S-lens电压50 V；二级碰撞能量设置为20、40、60 eV。

2.3 供试品溶液制备

取18批广金钱草药材、广金钱草对照药材，粉碎，过三号筛，取约1 g，精密称量，放置于具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇20 mL，称定其总质量，超声波处理(功率500 W，频率40 kHz)20 min，冷却至室温后，再次称其质量，用80%甲醇补足减量，摇晃均匀，过0.22 μm的滤膜，取其续滤液，置于液相小瓶，即得待测溶液。

2.4 特征图谱方法学考察

2.4.1 精密度实验 取其中一批广金钱草药材(S8)，根据“2.3”项下方法制备供试品溶液，根据“2.1”项下色谱条件重复进样 6 次，记录色谱图，以夏佛塔苷峰为参照峰，计算各色谱峰相对保留时间及相对峰面积，RSD值均小于3%，这个结果说明仪器精密度状态良好。

2.4.2 稳定性实验 取其中一批广金钱草药材(S8)，根据“2.3”项下方法制备供试品溶液，根据“2.1”项下色谱条件，分别在0、2、4、8、12、16、20、24 h进样测定。以夏佛塔苷峰为参照峰，计算相对保留时间和相对峰面积，实验结果表明，待测液在24 h内稳定，色谱峰的相对保留时间、相对峰面积的RSD值均小于3%。

2.4.3 重复性实验 取其中一批广金钱草药材(S8)，根据“2.3”项下方法制备供试品溶液，根据“2.1”项下色谱条件测定，以夏佛塔苷色谱峰为参照峰，计算其相对保留时间、相对峰面积，结果证实RSD值均小于 3%，这个结果说明该方法重复性良好。

2.5 广金钱草特征图谱建立

2.5.1 共有峰的确定 取广金钱草药材共18批，根据“2.3”项下方法制备供试品溶液，根据“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图，18批广金钱草药材特征图谱共有峰标识使用《中药色谱指纹图谱相似度评价软件》，并自动生成对照图谱，图1为18批广金钱草药材特征图谱叠加图，以平均数法生成药材广金钱草对照特征图谱，见图2。结果显示，7个特征峰存在于18批广金钱草药材的特征图谱中，其中，色谱峰3夏佛塔苷由于分离效果好、出峰稳定，因此选为参照峰，色谱峰4为异荭草苷，色谱峰6为异夏佛塔苷，色谱峰7为异牡荆苷，具有与广金钱草对照药材保持一致性的特征峰。通过计算广金钱草特征图谱共有峰的相对保留时间与相对峰面积，得到各共有峰的相对保留时间RSD值在0.00%～1.46%，相对峰面积的RSD在0.00%～20.34%，结果表明，不同产地广金钱草药材的各特征峰峰面积存在一定差异，色谱峰2相对峰面积范围为0.289～0.348，色谱峰4相对峰面积范围为0.131～0.259，色谱峰5相对峰面积范围为0.168～0.253，色谱峰6相对峰面积范围为0.568～0.663，色谱峰7相对峰面积范围为0.174～0.258。结果见表2、表3。

图1 18批广金钱草药材特征图谱

注：峰3(S)：夏佛塔苷；峰4：异荭草苷；峰6：异夏佛塔苷；峰7：异牡荆苷。

表2 18批广金钱草药材特征图谱相对保留时间

表3 18批广金钱草药材特征图谱峰面积

2.5.2 相似度评价[6]通过以18批广金钱草药材生成的共有模式(S0)作为对照特征图谱，与18批广金钱草药材进行相似度比较，相似度范围均超过0.9，这表明不同产地广金钱草药材相似度接近。市售广金钱草药材的相似度也较为接近，说明市售广金钱草质量较稳定。

2.5.3 广金钱草样品聚类分析[7]运用SIMCA 14.1软件对18批广金钱草药材样品进行系统聚类，聚类结果为广金钱草药材样品分为3类，Ⅰ类包括S4、S5、S7；Ⅱ类包括S8、S9、S12、S13、S15、S16、S18；Ⅲ类包括S2、S3、S17、S14、S6、S1、S10、S11。总体看，广东、广西市售的广金钱草药材质量差别不明显。见图3。

图3 18批广金钱草药材聚类分析结果

2.5.4 共有峰指认[8]通过与相应对照品保留时间比较，结合二级管阵列检测器光谱吸收曲线比对，初步确定色谱峰3为夏佛塔苷，色谱峰4为异荭草苷，色谱峰6为异夏佛塔苷，色谱峰7为异牡荆苷，结果见图4。取其中一批广金钱草药材(S1)待测液，参照“2.1”项下色谱条件和“2.2”项下质谱条件对待测样品进行分析，根据高分辨质谱提供的准确分子量与广金钱草已知组分的分子量进行对比，对于质量偏差小于3 ppm 的组分予以确认，且根据目标色谱峰的二级质谱信息，与 mzVault 标准数据库匹配进行进一步确认，结果见表4。

图4 广金钱草总离子流及紫外吸收色谱

表4 广金钱草药材共有峰质谱信息

3 讨论

广金钱草主要功效是清热除湿、利尿通淋，为岭南地区传统中药，临床上用于医治泌尿系结石，疗效十分显著[9-10]。黄酮类成分为广金钱草的主要药理活性成分，具有降血压，增加冠状动脉、脑、肾血流，有利尿、利胆及溶解或预防泌尿系结石等作用。广金钱草起抗炎、清热祛湿、利尿通淋等作用[9]的重要活性成分——夏佛塔苷及异夏佛塔苷[11-12]两者互为同分异构体，属于芹菜素黄酮碳苷类化合物。作为常用且用量较大的中药，广金钱草药材品质的优劣备受人们关注[13]，而更好地快速评价广金钱草药材的质量尤为重要。

本研究对特征图谱方法中的液相色谱柱、最佳吸收波长、流动相种类、流速及柱温分别进行了耐用性考察。经比较发现，UPLC CORTECS T3色谱柱(2.1 mm×150 mm，1.6 μm，Waters)分离效果最好，峰型比较好；考察了不同流动相体系，结果发现各色谱峰分离效果最好的条件是流动相乙腈-0.1%磷酸溶液。全波长扫描采用PDA，比较了不同检测波长下各色谱峰的响应，根据色谱结果，色谱峰最多的在340 nm 处，且各色谱峰响应值较高。

本实验通过特征图谱特征峰相似度评价分析，结合聚类分析对市售不同产地的广金钱草药材特征图谱进行分析总结，得出18批广金钱草药材特征图谱相似度超过0.9，这个结果表明，不同产地种植的广金钱草药材具有较高的相似度。本研究所用的18批广金钱草药材经由聚类分析软件分为3类，结合聚类分析、峰面积测定结果可知，两广地区生产的广金钱草药材质量稳定性好、差异性小。本研究通过广金钱草特征图谱特征峰方法，为广金钱草药材质量评价提供了一定依据，为今后深入研究广金钱草药材奠定了基础。