HPLC法测定苗药观音座莲中紫萁内酯苷的含量

封云倩，史辛夷，杨琼亚，郎天琼，罗国勇

(贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025)

苗药观音座莲，别名马蹄蕨，为观音座莲科观音座莲属的植物福建观音座莲(AngiopterisfokiensisHieron.)的根，具有祛风解毒、止血之效[1-2]。现代药理研究表明，观音座莲还具有抗HIV[3]、抗肿瘤[4]、抗氧化[5-6]和改善心绞痛[7]等作用，极具开发价值。药用资源的开发和利用，以建立可行的质量标准为前提。目前，观音座莲的质量标准仅包括水分、总灰分、酸不溶性灰分及浸出物等方面[8]，缺少有效成分的含量控制。根据Taveepanich S等[3]的研究结果，紫萁内酯苷具有显著抑制HIV-1逆转录酶的活性，并对肺癌细胞表现出显著的细胞毒作用，表明紫萁内酯苷是观音座莲中潜在的活性组分。基于此，结合前期开展的化学成分研究结果，拟建立苗药观音座莲中紫萁内酯苷的HPLC含量测定方法，以期为苗药观音座莲的质量控制奠定基础。同时，对叶子与根中紫萁内酯苷的含量差异进行比较分析，为观音座莲以根入药提供了理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

LC-2030C高效液相色谱仪(日本岛津公司)，超声波清洗仪KQ-400KDB型(昆山市超声仪器有限公司)，万分之一电子分析天平(上海卓精电子科技有限公司)，数显恒温水浴锅(上海力辰邦西仪器科技有限公司)。

1.2 材料

紫萁内酯苷对照品(实验室前期分离)；实验用苗药观音座莲来源见表1，经贵州中医药大学赵俊华教授鉴定为观音座莲科观音座莲属的福建观音座莲，植物标本存放于贵州中医药大学民族药重点实验室；甲醇为色谱纯(美国TEDIA天地试剂公司)；磷酸为分析纯(天津市科密欧化学试剂有限公司)；分析用水购于华润怡宝饮料有限公司。

表1 苗药观音座莲样品信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：ZORBAX SB-C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流动相：甲醇-0.1%磷酸水溶液等度洗脱(2∶98)；流速1.0 mL/min；柱温：40 ℃；检测波长：220 nm；进样量：2 μL。理论塔板数按紫萁内酯苷峰计算不低于11 360。

2.2 溶液配置

2.2.1 对照品溶液制备 称取紫萁内酯苷对照品10 mg，精密称定，置于10 mL容量瓶，加入适量甲醇溶解，再加甲醇定容至刻度，摇匀即得1.094 mg/mL的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液制备 称取福建观音座莲粉末0.5 g，精密称定，置于圆底烧瓶中，精密移取提取溶剂30%甲醇30 mL，称定质量，50 ℃下，加热回流提取1 h，冷却后补重，过滤，取续滤液，过0.22 μm微孔滤膜即得供试品溶液。

2.3 专属性实验

分别取对照品溶液、供试品溶液按“2.1”项下方法进样，在该色谱条件下，供试品中紫萁内酯苷与对照品色谱峰保留时间一致，与邻峰分离度>1.5。说明该方法专属性良好。色谱见图1。

注：A：对照品溶液；B供试品溶液。

2.4 线性关系考察

分别精密量取“2.2.1”项下对照品溶液1.0 mL、1.8 mL、2.6 mL、3.4 mL、4.2 mL、5.0 mL，置10 mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容，按“2.1”项下方法测定。以紫萁内酯苷浓度(mg/mL)为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程：Y=2 260 576.03X+4 710.3(Y为峰面积，X为对照品浓度)，r=0.999 9。紫萁内酯苷在0.101～0.505 mg/mL范围内，线性关系良好。

2.5 精密度试验

取“2.2.1”项下对照品溶液按“2.1”项下方法连续进样6次，测得紫萁内酯苷峰面积的RSD为0.54%。表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

按“2.2.2”项下的操作制备福建观音座莲供试品溶液于室温下放置0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h后，按“2.1”项下色谱条件进行进样分析，测得紫萁内酯苷峰面积的RSD为0.63%，表明供试品溶液在室温条件下24 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验

按“2.2.2”项下的操作平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行进样分析，测得紫萁内酯苷峰面积的RSD为1.2%，表明该方法重复性良好。该批次样品的平均含量为1.1%。

2.8 加样回收率试验

取已知含量的观音座莲末6份，每份0.25 g，含量按1.1%计算，精密量取1.034 mg/mL的紫萁内酯苷对照品溶液3 mL，分别加入6份样品中，按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行进样分析，计算回收率。结果紫萁内酯苷平均回收率(n=6)为97.33%，RSD为2.02%，表明本方法具有较好的加样回收率。见表2。

表2 加样回收试验结果

2.9 样品含量测定

实验前期对福建观音座莲的提取工艺进行考察，最终确定的提取方法为精密称取观音坐莲粉末1 g，以20%的甲醇作为溶剂，料液比为1∶20，在40 ℃下，超声时间为10 min，超声功率为240 W。分别取11批次福建观音座莲的叶子与根共22个样品按照上述提取方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行进样分析，并计算含量。样品含量测定结果见表3。

表3 11批次福建观音座莲的含量测定 (%)

2.10 统计学处理

表4 各组紫萁内酯苷的含量

表5 单因素ANOVA分析结果

3 讨论

3.1 检测波长选择

在紫外检测器220 nm及254 nm下进行扫描，发现在末端吸收220 nm下待测成分有良好的吸收，分离效果较理想，因此选择220 nm作为检测波长。

3.2 结果分析

通过对采集的11个批次药材进行分析发现，叶子中紫萁内酯苷的含量显著低于根中的含量(1.25% VS 3.97%；P<0.01)，这为苗药观音座莲以根入药提供了理论依据。导致叶和根中有效成分含量差异的原因可能有：①根茎类药材宜在秋冬季节采摘，而叶类药材则适合在其光合作用最强时采集。本次分析样品均在秋季采样，导致根中累积的紫萁内酯苷较多，而叶子的光合作用较弱，其紫萁内酯苷的含量较低。②在生长过程中，观音座莲的根部可能更有利于化学成分贮存。事实上，同一成分在同一植物的不同部位存在差异极其常见，如许婷等[9]通过对淫羊藿药材叶片、叶柄及茎3个部位进行研究表明，其叶片中黄酮类成分含量显著高于茎及叶柄；李红娟等[10]的研究结果显示，白茯苓、茯神与赤茯苓中三萜酸成分存在显著差异，以后者的茯苓酸含量最高。

4 结语

基于HPLC，建立了苗药观音座莲中活性成分紫萁内酯苷的含量测定方法。该方法简便快速、准确可行，为该药用资源的质量控制奠定了基础。进一步的含量分析结果显示，紫萁内酯苷在福建观音座莲根中的平均含量显著高于其在叶子中的含量，这为苗药观音座莲以根入药提供了理论依据。