经耳迷走神经刺激对急性创伤性颅脑损伤大鼠神经功能的改善作用及其机制

郑粲，王革生，王文鑫，王清华

1 北京中医药大学东方医院，北京100078；2 北京中医药大学东方医院神经外科

颅脑损伤是发生率仅次于四肢伤的常见创伤性疾病，发病率占全身各部位创伤的9%～21%，其致残、致死率高［1］。继发性颅脑损伤是患者致死、致残的主要原因，主要由于脑水肿逐渐加重，伴随颅内压升高、脑灌注减少，导致脑组织缺血和神经功能障碍。现阶段对颅脑损伤仍缺乏有效的治疗手段［2-3］。迷走神经刺激术（VNS）于上世纪九十年代中期开始用于治疗顽固性癫痫［4］，效果确切，不良反应较少且容易耐受。最近也有报道VNS 可用于颅脑损伤［5］、抑郁症［6］、头痛［7］、阿尔茨海默病［8］、脑卒中［9］、炎症［10］等疾病的治疗。虽然其作用机制尚不完全清楚，但有效性和安全性得到初步证实。根据VNS 及中医针灸理论，有学者提出用经皮电刺激耳部迷走神经分布区的方法即经耳迷走神经刺激术（t-VNS）治疗部分发作性癫痫［11］。该方法在保留VNS 有效性的基础上，避免有创性手术，而且不良反应少，治疗费用低。一项前瞻性临床研究证实，无创t-VNS 是安全且能够长期耐受的，可以作为癫痫患者的治疗选择［12］。YLIKOSKI等［13］和TU等［14］也分别证实了t-VNS对耳鸣和抑郁症有治疗作用。基于上述研究，2020年7月—2021年6月，本研究观察了t-VNS对急性创伤性颅脑损伤大鼠的神经保护作用，并初步探讨其机制，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要材料 清洁级3 月龄SD 雄性大鼠36 只，体质量（280 ± 20）g，由军事医学科学院实验动物中心提供，许可证号SCXK-（军）2012-0045。戊巴比妥钠购自北京冬歌生物公司。多聚甲醛购自北京尚柏生物公司。DAB浓缩显色剂、SABC试剂盒购自武汉博士德公司。兔抗大鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）单克隆抗体（一抗）、兔抗大鼠水通道蛋白4（AQP4）单克隆抗体（一抗）、兔抗大鼠巨噬细胞α7 烟碱型乙酰胆碱受体（α7nAChR）单克隆抗体（一抗）购自美国Sigma 公司。即用型快速免疫组化Max VisionTM试剂盒（二抗）、PBS 粉购自北京尚柏生物公司。实验用手术显微镜购自德国Carl Zeiss 公司。大鼠用恒温毯购自Gene&I 公司。Viking-Ⅳ型监测仪购自美国Nicolet 公司。牙科钻购自山东新华医疗设备厂。石蜡切片机购自德国Leica 公司。光学显微镜（BX400）购自日本Olympus 公司。自由落体脑损伤模型打击器（ZH-ZYQ 型）购自淮北正华生物仪器设备有限公司。自制耳夹式刺激电极。

1.2 动物分组、模型制备及治疗方法 实验动物按体质量大小编号，随机分成假手术组、模型组、治疗组，各12只。模型组和治疗组采用改良Feeney法制备急性创伤性颅脑损伤模型［15-17］：大鼠经1%戊巴比妥钠40 mg/kg 腹腔注射麻醉，头部固定于脑立体定向仪、消毒，沿中线切开头皮，分离至骨膜下显露颅骨，以冠状缝后4 mm、中线旁开3 mm 为中心磨开4 mm×4 mm 的骨窗（右侧）；40 g 砝码自25 cm 高度沿垂直导管自由下落，撞击撞针造成颅脑创伤；伤口滴注硫酸庆大霉素预防感染，骨蜡封闭骨窗，缝合头皮，充足水和食物喂养。以改良神经功能缺损评分（mNSS）为13 ～18 分判定为模型制备成功。假手术组仅切开头皮打开骨窗，不实施撞击。治疗组造模成功30 min 后给予t-VNS，用自制的耳夹电极夹于右侧耳甲腔迷走神经分布区，导线连接于Viking-Ⅳ型监测仪，刺激强度1 mA、间期0.5 ms、频率20 Hz，在1 h 内每隔5 min 刺激1 次，每次持续30 s，连续刺激3 d。模型组及假手术组不给予刺激。

1.3 神经功能评价 造模72 h 后采用mNSS 评价大鼠神经功能［15-16，18］。

1.4 脑含水量测算 神经功能评价后，以1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉处死大鼠，取出大脑，去除小脑、视神经、左侧大脑半球等，以损伤灶为中心冠状切开右侧大脑半球，取额侧一半组织测算脑含水量。滤纸吸尽表面血渍，置于烤干并称重的锡纸上，电子天平称脑组织湿重，然后放入95 ℃恒温箱烘烤24 h后称干重，根据公式计算脑含水量。脑含水量=（脑湿重－脑干重）/脑湿重×100%。

1.5 脑组织中AQP4、TNF-α、α7nAChR检测

1.5.1 Western blotting 法检测 取枕侧一半损伤灶处脑组织1 块，质量约100 mg，加入4 ℃预冷组织裂解液2 mL，匀浆，4 ℃下12 000 r/min 离心15 min，取上清液，采用考马斯亮蓝G250结合法检测总蛋白浓度。进行SDS-PAGE 蛋白电泳，将目的蛋白凝胶转移至PVDF 膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h；分别与兔抗大鼠AQP4、TNF-α、α7nAChR 一抗（1∶2 000）和兔抗大鼠β-actin一抗（1∶2 000）反应，4 ℃孵育过夜；与辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗（1∶1 000）室温孵育2 h；暗室内进行ECL 反应，X 线胶片显影、定影，凝胶成像分析系统采集并分析条带灰度值作为目的蛋白相对表达量。

1.5.2 免疫组化法检测 温生理盐水及4%多聚甲醛灌注取脑，取损伤灶处脑组织100 mg，4%多聚甲醛固定，经梯度乙醇脱水、二甲苯透明后，常规石蜡包理、切片。切片常规脱蜡至水，滴加3%H2O2孵育15 min，柠檬酸缓冲液微波法修复抗原20 min，自然冷却至室温，山羊血清室温封闭30 min；分别滴入一抗兔抗鼠AQP4、TNF-α、α7nAChR 抗体（1∶400），4 ℃孵育24 h；滴加二抗（山羊抗兔）室温反应30 min；滴加辣根过氧化物酶标记的卵白素工作液，室温反应15 min；DAB 显色剂呈色，梯度脱水、中性树脂封片。光镜下观察，细胞质有棕黄色颗粒者为阳性细胞。采用Image-Pro Plus6 软件分析平均光密度值作为蛋白相对表达量。

1.6 统计学方法 采用SPSS13.0 统计软件。对计量资料进行正态性检验，符合正态分布的数据以±s表示，多组比较采用方差分析，两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠mNSS 比较 造模72 h 后假手术组、模型组、治疗组mNSS 分别为0、（11.50 ± 1.73）、（8.33±2.42）分，模型组mNSS 高于假手术组，治疗组低于模型组（P均＜0.05）。

2.2 各组大鼠脑含水量比较 假手术组、模型组、治疗组脑含水量分别为76.05% ± 0.79%、81.65% ± 1.30%、79.15% ± 1.15%，模型组脑含水量高于假手术组，治疗组低于模型组（P均＜0.05）。

2.3 各组大鼠脑组织中AQP4、TNF-α、α7nAChR 表达比较 模型组AQP4、TNF-α蛋白表达高于假手术组（P均＜0.05）；治疗组AQP4、TNF-α 蛋白表达低于模型组，α7nAChR 蛋白表达高于模型组（P均＜0.05）。Western blotting 法检测结果见表1，免疫组化法检测结果见表2、图1。

图1 三组大鼠脑组织中AQP4、TNF-α、α7nAChR蛋白表达情况（免疫组化法）

表1 三组大鼠脑组织中AQP4、TNF-α、α7nAChR蛋Western blotting法检测结果比较（±s）

表1 三组大鼠脑组织中AQP4、TNF-α、α7nAChR蛋Western blotting法检测结果比较（±s）

注：与模型组相比，*P＜0.05。

组别治疗组模型组假手术组n 12 12 12 AQP4 0.54±0.06*0.76±0.05 0.13±0.03*TNF-α 0.49±0.06*0.87±0.06 0.18±0.04*α7nAChR 0.70±0.11*0.23±0.05 0.21±0.05

表2 三组大鼠脑组织中AQP4、TNF-α、α7nAChR蛋白免疫组化法检测结果比较（±s）

表2 三组大鼠脑组织中AQP4、TNF-α、α7nAChR蛋白免疫组化法检测结果比较（±s）

注：与模型组相比，*P＜0.05。

组别治疗组模型组假手术组n 12 12 12 AQP4 0.34±0.08*0.57±0.10 0.09±0.06*TNF-α 0.54±0.11*0.92±0.05 0.21±0.07*α7nAChR 0.63±0.10*0.19±0.07 0.16±0.08

3 讨论

外耳由3 种感觉神经支配，其中迷走神经耳支（Arnold 神经）是迷走神经在体表的惟一分支，分布于外耳廓耳甲腔、耳轮脚根部、耳甲艇，是迷走神经、面神经和舌咽神经的混合支。多项研究证实，电刺激耳 屏 内侧面相当于VNS［19-21］。BADRAN 等［22］和KRAUS 等［23］也发现，电刺激健康志愿者的左侧耳屏内侧面，杏仁核、海马、海马旁回等边缘系统的BOLD 信号下降，而岛叶、丘脑、中央前回的活动增强，这与VNS 所得结果一致［24-26］。因此，在临床治疗中，t-VNS具有替代甚至取代VNS的可能。

创伤性颅脑损伤是神经外科最常见的疾病之一，起病急骤，有很高的病死率及致残率，其有效救治及神经功能修复是临床难题。为了提高救治及修复效果，临床实践中尝试运用各种药物及方法进行治疗，但总体效果不佳。近年来，大量动物研究及临床研究证实，VNS 能够有效减轻创伤后继发性颅脑损伤，提高患者康复率及生存率［27］。VNS 主要是通过抑制氧化应激、炎症反应和减少细胞凋亡来减轻创伤后脑损伤［28］。

创伤性颅脑损伤后继发脑水肿是常见的病理生理表现，也是严重的并发症，能够引起颅内压升高甚至脑疝等。能否减轻脑水肿是临床救治创伤性颅脑损伤的关键环节。AQPs是一种质膜通道，能够促进水分子双向跨膜运输，与颅脑损伤后脑水肿发生密切相关。AQP4 是AQPs 家族重要成员之一，在哺乳动物脑组织中含量最丰富［29］。KITCHEN 等［30］发现，创伤性颅脑损伤后AQP4 表达显著增加，通过靶向抑制AQP4 表达可以明显减轻脑水肿。LOPEZ 等［31］研究显示，VNS 治疗组与假手术组大脑AQP4 表达水平相似，即VNS 可以调节大脑组织AQP4 表达，进一步减轻脑水肿。

炎症反应在创伤性颅脑损伤的病理生理机制中具有重要作用。颅脑损伤后产生一系列炎症反应，脑组织中大量炎症细胞聚集，促进炎症因子的释放，进一步加重脑损伤［32］。迷走神经能够很好地介导中枢神经系统与免疫系统之间的信息传导。VNS 可以通过多种途径及通路发挥抑制炎症的效应，从而起到保护脑组织、治疗类风湿关节炎等作用［33］。MASHIMO 等［34］研究表明，α7nAChR 作为炎症反应的效应器，其激活可以抑制相关炎症因子分泌，在调控炎症因子产生的过程当中发挥着关键作用。VNS后，乙酰胆碱在神经末梢释放，与免疫细胞上的α 7nAChR结合，通过细胞内信号转导途径阻止炎症因子TNF-α、IL-6 等的释放，对炎症反应进行调节［33，35］。

本研究结果显示，治疗组mNSS、脑含水量及脑组织中AQP4 表达低于模型组，提示治疗组的脑水肿程度较模型组轻，神经功能恢复程度更好，其机制可能是t-VNS 能够降低AQP4 的表达，减轻脑水肿，从而改善预后。同时，治疗组脑组织中TNF-α 表达低于模型组、α7nAChR 表达高于模型组，提示t-VNS可能通过上调α7nAChR 表达、抑制TNF-α 等炎症因子释放，从而减轻创伤性颅脑损伤的脑组织炎症反应。结合本研究的各项结果，我们认为，在创伤性颅脑损伤的治疗中，t-VNS 可能具有和VNS 相近的效果和作用机制。近年来，t-VNS 被用于多个学科的基础及临床研究中，如自主神经功能、疼痛、炎症、心血管系统、心理及认知功能、消化系统等［36］，t-VNS通过利用机体自身保护机制，针对症状产生的根本因素进行调节从而减轻症状，是一种值得深入探索和研究的新型治疗方式。

综上所述，t-VNS 对急性创伤性颅脑损伤大鼠具有神经保护作用，其机制可能与下调AQP4 表达、上调α7nAChR表达、减轻炎症反应有关。