轻度认知功能障碍患者肠道菌群丰度变化及健脾补肾中药复方还少丹干预效果观察

陈颖，刘雪辉

1 成都中医药大学临床医学院，成都610075；2 成都中医药大学附属医院老年干部科

轻度认知功能障碍（MCI）被认为是介于生理衰老与痴呆的中间状态，属于一种神经系统退行性病变。MCI 患者是阿尔茨海默病（AD）发病的高危人群。流行病学资料显示，每年有10 %～15 %的MCI患者可进展为AD［1］。近年研究表明，肠道微生物群能通过“肠道—微生物群—脑轴”途径与神经功能相互影响，肠道微生态紊乱可能与MCI 的发生或进展有关［2］。MCI 可归属于中医学“健忘”“善忘”等范畴。研究发现，脾肾两虚证与患者总体认知损害相关，且年龄越大则脾肾两虚证越严重［3-4］。相关药理研究发现，健脾补肾类中药复方能改善学习认知功能，并与肠道微生物相互作用，影响肠道内环境，有助于益生菌生长，充当益生元的角色［5］。本研究旨在观察MCI患者肠道菌群丰度变化及中医健脾补肾法的干预效果，以期进一步揭示MCI的发病机制，为还少丹治疗MCI 提供科学依据，也为MCI 的治疗提供新思路。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2020年12月—2021年6月成都中医药大学附属医院门诊、住院及医院周边社区的MCI 患者24 例作为研究对象。纳入标准：①符合MCI的诊断标准；②符合中医脾肾阳虚证诊断标准；③年龄在50 ～85岁，男女均可；④自愿参加本研究，并签署知情同意书。排除标准：①评定为正常或痴呆者；②目前患者有精神分裂症、分裂情感性障碍或原发性成人情感性障碍，包括有成人情感性障碍病史者或伴有严重神经缺损患者，如各种失语、失认者；③患有AD、血管性痴呆、中枢神经系统感染、创伤后痴呆、中毒代谢性脑病、亨廷顿病、多发性硬化、震颤性麻痹等且诊断在记忆衰退之前，精神发育不全、原发的未经治疗的内分泌疾病如Cushing综合征或原发下丘脑功能减退（甲状腺机能减退已治愈者不除外）；④合并有心、脑、肝、肾和造血系统严重原发疾病患者；⑤有严重消化不良、胃肠道梗阻、消化道溃疡的患者，合并其他影响药物吸收的胃肠道疾病患者；⑥对本研究药物过敏者；⑦近期曾系统接受过其他中西医益智药物及口服益生菌治疗的患者。采取随机数字表法将MCI患者分为观察组和对照组各12 例。观察组男4 例、女8 例，年龄（80.33 ±8.55）岁，BMI 22.30 ± 2.19，受教育程度为中学及以上9 例、小学3 例。对照组男5 例、女7 例，年龄（83.33 ± 7.13）岁，BMI 22.74 ± 2.74，受教育程度为中学及以上10 例、小学2 例。两组患者性别、年龄、BMI、受教育程度等基线资料差异无统计学意义。另选同期来院体检的健康人12 例作为健康对照组，男7 例、女5 例，年龄（79.08 ± 4.56）岁，受教育程度为中学及以上9例、小学3例。本研究遵循赫尔辛基宣言，获得成都中医药大学附属医院伦理委员会审查批准（伦理批准号2020KL-081）。研究期间观察组和对照组无脱落、失访病例。

1.2 肠道菌群丰度及生物信息学分析 对MCI 患者和健康对照组的肠道菌群分布进行分析。根据相似度水平差异，对16S rDNA 测序得到的全部序列进行运算分类单元（OTU）聚类分析，利用USEARCH软件在97%相似度下聚类得到OTU 代表序列，与数据库比对，进行OTU 物种注释。基于OTU 和注释结果进行α 多样性、β 多样性、组间物种差异、功能差异等分析。α 多样性分析反映群落的丰度和多样性，常用包括Shannon 指数、Simpson 指数。利用QIIME2 软件计算Weighted Unifrac 距离矩阵分析β多样性。应用LEfSe 分析组间差异菌群，默认线性判别分析筛选值为2.0（≥2.0被认为差异显著）。采用PICUSt 软件对样本中可能存在的肠道菌群对应各级KEGG通路及丰度值进行预测。

1.3 健脾补肾法中药复方干预观察

1.3.1 治疗方法 对照组予以基础治疗，包括一般健康养生宣教（积极调治旧疾，保持心情舒畅）；八段锦锻炼，每日1 次，每次30 min。观察组基础治疗同对照组，同时予以中药还少丹免煎颗粒（由四川新绿色药业科技发展有限公司提供）。还少丹药物组成：熟地黄15 g、枸杞子15 g、肉苁蓉10 g、巴戟天10 g、怀牛膝10 g、山茱萸10 g、五味子10 g、山药10 g、茯苓10 g、远志10 g、石菖蒲10 g、法半夏10 g、杜仲10 g、楮实子10 g。每日1 剂，每 日3 次，于三餐后30 min 以100 mL 温开水冲化后口服。两组疗程均为12周。

1.3.2 认知功能评估方法 在治疗前及疗程结束后采用简易精神状态量表（MMSE）评分和蒙特利尔认知评估量表（MoCA）评分评价认知功能。

1.3.3 中医证候积分方法 根据《中药新药临床研究指导原则》及《轻度认知损害临床研究指导原则》制订的中医证候积分表，依据主要症状、次要症状的严重程度分别赋分（主要症状赋0、2、4、6分，次要症状赋0、1、2、3分），采用尼莫地平法进行评价。

1.3.4 疗效评估方法 根据《中药新药临床研究指导原则》及《轻度认知损害临床研究指导原则》，患者症状、体征消失或基本消失，疗效指数≥80%为临床控制；患者症状、体征明显改善，50%≤疗效指数＜80%为显效；患者症状、体征均好转，30%≤疗效指数＜50%为有效；患者症状、体征无明显改善或加重，疗效指数＜30%为无效。

1.3.5 治疗安全性评价方法 两组治疗期间检测血常规、尿常规、大便常规、肝功能（ALT、AST）、肾功能（BUN、Cr），并进行心电图检查。记录不良反应发生情况。

1.3.6 肠道菌群丰度检测方法 采集观察组和对照组新鲜粪便，在4 h 内放入-80 ℃冰箱冻存。对基因组DNA 样品进行提取、扩增，Agencourt AMPure XP 磁珠对PCR 扩增产物进行纯化，完成建库，选择HiSeq 平台进行测序。下机数据过滤，得到高质量Clean data，使用FLASH1.2.11 软件，利用重叠关系将reads 进行拼接，得到高变区的Tags，将Tags 聚类成运算分类单元。采用Mothur 方法与SILVA（http：//www.arb-silva.de/）的SSUrRNA 数据库进行物种分类学分析（设定阈值为0.8 ～1.0）。

1.4 统计学方法 采用SPSS25.0统计软件。计量资料进行Kolmogorov-Smirnov正态性检验，符合正态分布的计量资料以±s表示，两组间比较采用独立样本t检验；不符合正态分布的计量资料组内比较采用Wilcoxon秩和检验，组间比较采用Mann-WhitneyU检验。计数资料采用χ2检验。MoCA、MMSE 评分与肠道菌群分布的相关性采用Spearman 相关分析法。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MCI 患者肠道菌群丰度变化 MCI 患者及健康受试者肠道中厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门是优势菌门。与健康对照组相比，MCI患者厚壁菌门、变形菌门、放线菌门、疣微菌门丰度增加，而拟杆菌门丰度降低。基于Weighted Unifrac 距离的主坐标分析及差异盒型图的β 多样性分析显示，MCI 患者与健康对照组肠道菌群构成存在差异，门、纲及科水平的菌群组成不同。草酸杆菌科、草酸杆菌属、梭状芽胞杆菌属、大芬戈尔德菌、帕拉普菌属、Odoribacter、Oribacterium、巴斯德菌科、巴斯德菌目、嗜血杆菌属、艾森伯格菌属是差异显著种群。MCI 患者艾森伯格菌属、变形菌门下的巴斯德菌科及嗜血杆菌属富集。应用各级KEGG 预测MCI患者与健康对照组差异分布肠道菌群对应的功能类别，两组有8 条通路差异具有统计学意义，分别为柠檬酸盐循环、玉米素生物合成、糖酵解/糖异生、丙酮酸代谢、真核生物的核糖体生物发生、原核生物中的碳固定途径、β-丙氨酸代谢、N-聚糖生物合成。两组差异分布肠道菌群在氨基酸、脂肪、碳水化合物、核苷酸、萜类和多酮类代谢相关的微生物功能存在差异。

2.2 MCI 患者健脾补肾法治疗效果 观察组治疗后MMSE、MOCA 评分高于对照组，中医证候积分低于对照组（P均＜0.05）。见表1。治疗12 周后，观察组临床控制1例、显效9例、有效1例、无效1例，总有效率91.67%；对照组显效4 例、有效1 例、无效7 例，总有效率41.67%。观察组总有效率高于对照组（P＜0.05）。研究过程中，两组患者生命体征、血常规、肝肾功能、心电图检查均未出现明显异常。

表1 两组MCI患者治疗前后MMSE、MOCA评分及中医证候积分比较（分，±s）

表1 两组MCI患者治疗前后MMSE、MOCA评分及中医证候积分比较（分，±s）

注：与同组治疗前相比，*P＜0.05；与对照组治疗后相比，#P＜0.05。

组别观察组治疗前治疗后对照组治疗前治疗后n 12 12 MOCA 评分20.58±2.11 22.42±2.02*#20.33±2.27 20.42±2.31 MMSE评分23.67±0.99 25.42±0.67*#24.00±0.74 24.17±1.27主要症状积分11.80±1.80 4.17±1.80 11.60±1.88 6.50±2.71次要症状积分16.75±2.14 5.75±2.83 16.42±2.81 11.58±3.84总体积分28.58±2.84 9.92±3.87*#28.08±3.53 18.08±6.42*

2.3 MCI 患者健脾补肾法治疗前后肠道菌群丰度变化 在门种水平上，两组MCI 患者治疗后厚壁菌门、放线菌门、疣微菌门、变形菌门丰度下降，拟杆菌门丰度增加（P均＜0.05）；在属种水平上，观察组治疗后梭状芽胞杆菌属、Oribacterium 丰度增加，嗜血杆菌属丰度降低（P均＜0.05）。对照组治疗前后差异无统计学意义。MCI 患者治疗后肠道菌群在门种水平上与健康对照组差异无统计学意义；在属种水平上，MCI 患者治疗后梭状芽胞杆菌属、Oribacterium 丰度低于健康对照组，嗜血杆菌属、艾森伯格菌属丰度高于健康对照组（P均＜0.05）。见表2、表3。

表2 三组肠道菌群门种丰度比较（±s）

表2 三组肠道菌群门种丰度比较（±s）

组别观察组治疗前治疗后对照组治疗前治疗后健康对照组n 12 12 12厚壁菌门50.482±7.438 47.053±9.375 50.316±8.013 48.749±7.723 45.080±5.342拟杆菌门19.836±6.905 28.961±4.070 18.949±6.181 20.592±6.690 39.847±7.032放线菌门5.064±5.860 3.026±4.329 5.681±6.045 4.777±5.998 1.490±1.747疣微菌门3.679±2.136 1.868±0.907 3.277±1.903 2.027±1.664 2.150±1.990变形菌门18.428±6.529 13.596±8.033 18.869±5.805 15.119±6.340 11.274±6.888

表3 三组肠道菌群属种丰度比较（±s）

表3 三组肠道菌群属种丰度比较（±s）

注：与健康对照组相比，*P＜0.05；与对照组相比，#P＜0.05；与同组治疗前相比，△P＜0.05；0代表样本物种丰度极小，忽略不计。

组别观察组治疗前治疗后对照组治疗前治疗后健康对照组n 12 12 12艾森伯格菌属0.075±0.064*0.067±0.166*0.074±0.171*0.070±0.165*0.031±0.069梭状芽胞杆菌属1.584±0.602*2.464±2.678#△1.588±0.413*1.589±0.412*2.682±1.575嗜血杆菌属0.467±0.625*0.019±0.033#△0.477±0.825*0.423±0.850*0.018±0.031 Oribacterium 0*0.001±0.001#△0*0*0.001±0.002

2.4 MCI 患者MOCA、MMSE 评分与肠道菌群丰度的相关性 相关性分析结果显示，MCI 患者拟杆菌门丰度与MMSE 评分呈正相关（r=0.398，P＜0.05），梭状芽胞杆菌属丰度与MOCA、MMSE 评分呈正相关（r分别为0.388、0.422，P均＜0.05），嗜血杆菌属、艾森伯格菌属丰度与MOCA 评分呈负相关（r分别为-0.372、-0.373，P均＜0.05）。

3 讨论

人体与微生物密不可分，人体内最大、最复杂的微生态系统位于胃肠道，由于面积广、菌种繁多复杂，被称为“人体第二基因组”。微生物尤其是肠道微生物与参与人体的新陈代谢，影响营养吸收和代谢，与健康息息相关。越来越多的研究表明，肠道菌群在认知功能障碍的发生发展中有重要作用［6］。肠道菌群影响认知功能的机制主要集中在以下几方面［7-9］：菌群产生短链脂肪酸及脂多糖等成分影响中枢神经系统；肠道菌群产生神经递质调节大脑记忆功能；肠道微生态平衡破坏可刺激炎症因子损害血脑屏障，导致神经退行性变，影响认知功能。

既往研究发现，成年人肠道菌群中厚壁菌门及拟杆菌门是主要菌群，约占细菌组成的90%，其他变形菌门、放线菌门等比例较小［10］。变形菌门是细菌中最大的门，在健康成人肠道中占比较小，其富集被认为与肠道菌群失调密切相关［11-12］。变形菌门细胞壁富含高度炎症成分（如脂多糖），可诱导低级别全身炎症，加重认知障碍。本研究结果显示，MCI组肠道微生物α 多样性总体指数稍低，拟杆菌门等有益菌比例明显降低，而促进炎症的微生物群如变形菌门等有害菌比例明显升高；观察组治疗后变形菌门丰度下降，拟杆菌门等有益菌肠道菌群多样性更为丰富，属种水平上梭状芽胞杆菌属、Oribacterium 丰度增加，嗜血杆菌属丰度降低。一项研究发现，MCI患者肠道厚壁菌门、变形菌门丰度增高，拟杆菌门丰度降低，与本研究结果一致［13］。本研究中，MCI患者菌群特征主要表现为艾森伯格菌属及变形菌门下γ-变形菌纲的巴斯德菌科、嗜血杆菌属富集，梭状芽胞杆菌属、Oribacterium 减少，提示MCI 患者存在肠道菌群失衡。嗜血杆菌属是常寄生于上呼吸道的条件致病菌［14］，在MCI患者肠道中，其丰度高于健康对照组，提示MCI 患者胃肠道可能被定植在身体其他部位的微生物入侵，其表面的多糖成分在感染过程中起关键作用［15］。已有研究表明，致病菌或肠道菌群失调可导致血脑屏障通透性增加，而肠道屏障和血脑屏障受损或改变可能有利于微生物繁殖，代谢物生成增多，抗原或激活的免疫复合物可从肠道到血液循环系统，最终到达包括脑实质在内的其他组织，引起神经炎症，导致神经退行性变［16］。KEGG 分析显示，MCI 患者差异表达肠道菌群的微生物功能主要涉及氨基酸、脂肪、碳水化合物、核苷酸、萜类和多酮类等代谢方面［17］，提示肠道微生物可直接或间接通过多种途径与中枢神经系统相互作用，具体菌种及代谢机制需进一步深入研究。

MCI 可归属于中医学“健忘”“善忘”等范畴，其病位在脑，与心肝脾肾功能失调密不可分，尤其是脾肾。中医认为脑为元神之府，精髓之海，赖肾精充养。肾藏精，精生髓，上输于脑，精足髓充，令人智慧灵活；若肾精亏虚，髓减脑消，则神明失养。脾为后天之本，气血生化之源，脾气与肾气相互充养，若脾气虚弱，一则气血生化不足，肾精失养，二则积饮为痰，痰蒙脑窍。因此，临证多健脾补肾以治本。

还少丹见于《杨氏家藏方》，也见于《洪氏集验方》，可用于补益脾肾，治疗未老先衰、神志俱耗、体倦腰酸等多种因脾肾虚弱导致的证候。方中熟地黄滋养先天之本，能“封填骨髓”；现代药理证实，熟地黄中梓醇能抑制氧化应激，延缓认知障碍的进展［18］。枸杞子入足少阴肾经，陶通明言其“补益精气，强盛阴道”，与熟地合用补肾水以济命火，使火不亢不害。杜仲、怀牛膝补肾壮腰膝。茯苓、山药均入脾、肾经，《用药心法》称茯苓为“除湿之圣药”，其水煎液能降低脑内乙酰胆碱酯酶活性［19］，改善小鼠记忆力，茯苓与山药合用可补中健脾。山茱萸、五味子收涩而固精。远志、石菖蒲是多数医家治疗健忘常用药物，《神农本草经》中记载远志“益智慧，耳目聪明，不忘，强志倍力”；石菖蒲中β-细辛酮有保护心脑血管和神经的作用，有助于治疗记忆障碍［20］。楮实子助阳补虚，交补脾肾，法半夏燥湿健脾。诸药合用，全方共奏补益脾肾之效。既往研究发现，还少丹可以减低N-甲基-D-天冬氨酸受体活性，增强脑内过氧化氢酶的活性，促进乙酰胆碱合成，改善学习和记忆能力［8］。本研究结果显示，观察组MOCA、MMSE评分及总有效率高于对照组，中医证候积分下降更显著，表明还少丹能有效改善MCI 患者的认知功能。观察组治疗后变形菌门、嗜血杆菌属丰度明显减少，拟杆菌门、梭状芽胞杆菌属、Oribacterium 丰度增加，提示还少丹可一定程度改善MCI患者肠道微生物平衡。相关性分析结果显示，MCI 患者拟杆菌门丰度与MMSE 评分呈正相关，梭状芽胞杆菌属丰度与MOCA、MMSE 评分呈正相关，嗜血杆菌属、艾森伯格菌属丰度与MOCA 评分呈负相关，提示肠道菌群与认知障碍进展存在一定联系。

综上所述，MCI 患者与健康人肠道菌群丰度存在明显差异，且差异菌群与认知功能相关。还少丹可以安全、有效改善MCI 认知功能，减轻临床证候，其作用机制可能与调节患者肠道菌群有关。MCI患者与正常人的差异肠道菌群有望成为研究及治疗MCI的潜在靶点。还少丹治疗MCI的其他机制还有待进一步研究。鉴于本研究样本量小，以上结论尚需大样本研究加以验证。