加味当归芍药散治疗后慢性子宫内膜炎大鼠子宫内膜胞饮突发育及NF-κb、TGF-β1蛋白表达变化

靖文君，蔡平平，王雨琦，李洁颖，李克勤

1 山东中医药大学第一临床医学院，济南250014；2 山东第一医科大学附属省立医院中医科

慢性子宫内膜炎（CE）是降低子宫内膜容受性的关键因素之一，常导致反复种植失败（RIF）［1-2］。目前西医治疗该病大多应用抗生素、宫腔灌注、内膜搔刮等方法，但复发率较高［3］。中医药治疗CE 具有显著优势［4］。多项研究表明，当归芍药散在抗炎、改善子宫血流等方面效果显著［5-7］。李克勤教授为山东省名中医、第五批全国老中医药专家学术继承指导老师，经过多年实践经验，运用加味当归芍药散治疗RIF合并CE 的患者，疗效显著。2020 年12 月—2021 年8月，本研究采用加味当归芍药散治疗CE 大鼠，观察大鼠子宫内膜表面胞饮突的发育情况及大鼠子宫组织中NF-κB、TGF-β1蛋白表达变化，初步探讨加味当归芍药散治疗CE的作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料

1.1.1 实验动物 SPF 级实验SD 雌性大鼠60 只，体质量180～200 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号SCXΚ（京）2016-0011，饲养于山东省立医院动物房。所有大鼠在实验室普通清洁环境下饲养，适应性喂养7 d后开始实验。本实验经山东省立医院实验动物伦理委员会批准。

1.1.2 药物及试剂 加味当归芍药散，由当归15 g、川芎12 g、赤芍9 g、茯苓15 g、炒白术12 g、丹参6 g、红花6 g、燀桃仁12 g、党参15 g、薏苡仁9 g、败酱草9 g、大血藤9 g、蒲黄9 g、甘草6 g 组成，中药饮片购自山东第一医科大学附属省立医院中药房，按照中药饮片煎煮规范，使用蒸馏水煎煮药物，最终将中药液浓缩至分别含生药2.592、1.296、0.648 g/mL，分装，4 ℃保存备用。妇科千金胶囊，每粒0.4 g，株洲千金药业有限公司生产，生产批号Z20020024。GAPDH抗体（稀释比1∶2 000）、HRP 标记山羊抗兔（稀释比1∶5 000）、HRP 标记山羊抗鼠（稀释比1∶5 000）、SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒、RIPA 裂解液、ECL显影试剂盒购自武汉赛维尔生物科技有限公司。NF-κB p65 抗 体（稀 释 比1∶2 000）、TGF-β1抗 体（稀释比1∶5 000）购自武汉三鹰生物技术有限公司。BAC 蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。25%苯酚凝胶由西黄芪胶1 g、苯酚5 mL、甘油4 mL 加蒸馏水至20 mL 配置。电镜固定液购自北京索莱宝科技有限公司。

1.1.3 仪器 PowerPac型电泳仪、转膜仪购自美国Bio-Rad 公司。ME235S 电子天平购自德国Sartorius公司。Multiskan GO 全波长酶标仪购自美国Thermo Fisher 公司。Vortex3000 涡旋振荡器、SLΚ-O3000-S摇床购自美国SCILOGEX 公司。GL-150b 干式恒温器购自海门市其林贝尔仪器制造有限公司。Fluor Chem R 多功能成像分析系统购自美国Protein Simple 公司。Quorum 临界点干燥仪（Κ850），HITACHI离子溅射仪（MC1000），HITACHI 扫描电子显微镜（SU8100）。

1.2 动物分组、模型制作及给药方法 将60只大鼠随机分为空白组、模型组、中药高剂量组、中药中剂量组、中药低剂量组、妇科千金胶囊组，每组10 只。空白组正常饲养，模型组、中药高剂量组、中药中剂量组、中药低剂量组、妇科千金胶囊组使用25%苯酚胶浆制备CE 模型［8-9］：大鼠术前禁食不禁水12 h，使用1%戊巴比妥钠（0.02 g/kg）腹腔注射麻醉大鼠，在大鼠下腹正中行0.8～1.0 cm纵向切口，暴露子宫，用0.25 mL注射器配4号针头，于子宫分叉处左侧朝卵巢方向进针，缓缓推注25%苯酚胶浆0.05 mL［10］，右侧子宫不作处理作为自身对照，分层缝合关腹，消毒术区，同时将术后大鼠放入干净整洁的饲养笼内，保温至苏醒状态。造模1周后，造模各组随机解剖2只大鼠，肉眼观察见大鼠左侧子宫管壁变薄，管腔内可见大量黄色或清亮液体，管腔呈重度扩张，子宫浆膜面可见充血、肿胀，颜色暗红，提示造模成功。造模成功当天，按照成人等效剂量折算系数6.3［11］，中药高、中、低剂量组分别给予25.92、12.96、6.48 g/kg的加味当归芍药散灌胃；妇科千金胶囊组给予0.216 g/kg的妇科千金胶囊灌胃；空白组、模型组给予等量生理盐水灌胃。各组均按照10 mL/kg 体积给药，给药21 d进行后续观察与检测。

1.3 大鼠子宫内膜胞饮突观察方法 末次给药后24 h，各组大鼠均腹腔注射1%戊巴比妥钠（0.02 g/kg）麻醉，剪取大鼠左侧子宫组织，称重、切段分装，取其中一部分子宫组织用PBS充分洗涤后投入电镜固定液中室温固定2 h、4 ℃固定3 h，用PBS 漂洗3次、每次10 min，锇酸室温避光固定2 h，PBS 再次漂洗3 次、每次10 min，乙醇逐级脱水，于乙酸异戊酯中放置15 min后，放入临界点干燥仪内干燥，干燥后于离子溅射仪样品台上喷金30 s，使用HITACHI 扫描电子显微镜观察胞饮突，并采集图像。

1.4 大鼠子宫组织中NF-κB、TGF-β1蛋白检测方法 取另一部分大鼠子宫组织在预冷的RIPA 裂解液中进行匀浆处理，收集各组大鼠子宫组织总蛋白，BCA 试剂盒进行蛋白定量。使用8% SDS-PAGE 凝胶进行电泳，将目的蛋白转移到PVDF 膜上，脱脂奶粉封闭120 min，加入GAPDH、NF-κB、TGF-β1一抗，4 ℃孵育过夜。经TBST 洗涤3 次、每次15 min，按说明书稀释并加入经辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育60 min，TBST 洗膜3 次、每次15 min，最后用化学发光显影法进行显影。于凝胶成像系统中采集图像信息，以GAPDH 为内参，用Image J 软件分析各组蛋白条带的灰度值。

1.5 统计学方法 采用SPSS25.0 统计软件。分别采用Κolmogorov-Smirnov检验、Levene检验对计量资料进行正态性检验和方差齐性检验，符合正态分布的计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用最小显著性差异法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠子宫内膜表面胞饮突发育情况 空白组子宫内膜表面形态规整，胞饮突丰富表达，圆润饱满，上皮细胞分布均匀，形态大小基本一致，细胞间界限清楚。模型组子宫内膜局部有少量胞饮突表达，形态大小不一，微绒毛较多，细胞间分界不清。妇科千金胶囊组及中药低剂量组子宫内膜表面细胞形态欠规整，不饱满，胞饮突发育较小，细胞界限欠清。中药高、中剂量组子宫内膜表面形态较规整，细胞表面可见较多胞饮突，细胞之间的间隙明显。见图1。

图1 各组大鼠子宫内膜表面胞饮突表达情况（扫描电子显微镜）

2.2 各组大鼠子宫组织NF-κB、TGF-β1蛋白表达比较 见表1。

表1 各组大鼠子宫组织中NF-κB、TGF-β1蛋白样本表达比较（±s）

表1 各组大鼠子宫组织中NF-κB、TGF-β1蛋白样本表达比较（±s）

注：与模型组相比，#P＜0.01；与空白组相比，*P＜0.01。

组别中药高剂量组中药中剂量组中药低剂量组妇科千金胶囊组模型组空白组n 10 10 10 10 10 10 NF-κB蛋白0.46±0.23#0.56±0.10#0.60±0.03 0.59±0.20#0.72±0.23*0.51±0.23 TGF-β1蛋白1.10±1.08#1.33±1.32#1.54±1.35 1.57±1.78#2.54±3.88*1.34±1.36

3 讨论

CE 发病机制尚未完全阐明。研究表明，链球菌、大肠埃希菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌等病原微生物感染或单纯疱疹病毒、巨细胞病毒等病毒感染与CE有关［12］。长期CE状态引起的宫腔微环境改变会导致女性子宫内膜容受性降低，造成RIF、复发性流产等，危害女性身心健康［13］。目前西医治疗CE以控制炎症、修复内膜为主，治疗效果因人而异。妇科千金胶囊是治疗CE的中成药制剂，功效为清热利湿，益气化瘀，具有抑制细菌繁殖、减轻炎症、调控免疫等作用［14］，属于临床妇科炎症疾病的常用药物。

CE 属于中医“带下病”“妇人腹痛”“不孕症”等范畴，多因经行、产后或产伤，感染病邪致湿热下聚胞宫；或七情内伤，肝脾不调，疏运失常，湿热循经下注，阻滞胞宫气机，气滞血瘀，内膜不得荣养；或由周围炎症蔓延而来，以致病邪侵袭内膜而致病。《傅青主女科》言：“带下俱是湿证。”朱丹溪曾云：“血受湿热，久必凝浊。”可见CE 病因病机以湿热瘀阻为主，治疗当以祛湿行瘀为主。李教授经验方加味当归芍药散，以当归芍药散为基础进行加减化裁，方中当归补血活血，川芎行气活血，赤芍凉血散瘀，丹参、红花、桃仁活血祛瘀，茯苓、白术、党参健脾渗湿，薏苡仁健脾利水、解毒散结，败酱草清热解毒、消肿排脓，甘草调和诸药。全方以健脾除湿、活血化瘀为主要功效，契合CE的湿热瘀结病机。

胞饮突被认为是评价子宫内膜容受性超微结构标志之一［15］。对于RIF 患者，胞饮突是预测胚胎植入时机的指标。足量的、发育成熟的胞饮突有利于胚胎着床，提高妊娠成功率［16］。本研究结果显示，与空白组相比，模型组大鼠子宫内膜表面胞饮突发育不成熟且数量少；与模型组相比，中药高、中剂量组大鼠子宫内膜表面胞饮突发育趋向成熟且数量较多，妇科千金胶囊组、中药低剂量组子宫内膜表面胞饮突发育程度中等且数量较少。由电镜结果可知，加味当归芍药散能够有效改善胞饮突的发育程度。

NF-κB 是一种重要的细胞核转录因子，参与炎症相关基因的转录调控，诱导趋化因子、生长因子、免疫受体、应激相关酶及急性期蛋白表达等，其可聚集炎症细胞，从而引起一系列炎症相关性疾病［17］。TGF-β1是TGF-β 家族中作用最强的一类相关生长因子，对细胞的生长分化、迁移、凋亡及细胞外基质生成均有调节作用。当机体发生炎症反应性疾病时，TGF-β1表达增强，抑制T细胞和巨噬细胞的增殖和活性，从而抑制免疫作用，介导促炎因子的合成和分泌，加重炎症反应的侵袭性与组织损伤。若TGFβ1高水平表达持续存在，会导致正常器官组织的纤维化［18-19］。因此，下调NF-κB、TGF-β1表达，可以抑制过度的免疫反应，从而减少炎症介质的表达［20］。本研究结果显示，模型组大鼠子宫组织中NF-κB、TGF-β1蛋白表达高于空白组，中药高、中剂量组和妇科千金胶囊组NF-κB、TGF-β1蛋白表达低于模型组，提示加味当归芍药散可下调NF-κB、TGF-β1蛋白的表达，减轻CE 大鼠子宫内膜的炎症反应，进而提高子宫内膜容受性。

结合上述研究结果，我们认为，CE 大鼠子宫内膜容受性下降与胞饮突发育不良及NF-κB、TGF-β1蛋白表达异常有关，而加味当归芍药散能够通过改善CE 大鼠子宫内膜表面胞饮突的发育，并下调NF-κB、TGF-β1蛋白表达水平，从而有效改善CE 大鼠的子宫内膜容受性，这为中医药治疗CE患者尤其是合并RIF的患者提供了研究基础。