骨髓间充质干细胞在缺血性脑卒中的治疗作用

付丽环，江小霞，毛更生

脑卒中是全球第二大死亡原因，也是导致成人残疾的主要原因之一，随着老龄化到来，其发病率目前仍在增加[1-2]，其中缺血性脑卒中约占所有脑卒中的85%以上[3]。组织型纤溶酶原激活剂(tissue plasminogen activator，t-PA)是目前治疗缺血性脑卒中的有效药物之一[4]，但缺血性脑卒中发作后脑细胞的快速损伤和死亡使得t-PA必须在发生缺血性脑卒中后4.5 h内使用，所以绝大多数患者得不到t-PA的及时救治[5]。目前这种局限性无法改变，所以关于缺血性脑卒中的研究策略已转向神经修复疗法，尤其强调各种干细胞的再生治疗。在各种类型的候选干细胞中，骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是修复缺血性脑卒中的一种很有前途的干细胞类型，移植BMSCs可直接或间接修复局灶性缺血区，促进神经功能改善[6-7]。但BMSCs治疗缺血性脑卒中的机制目前还未完全明朗，亟需进一步研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 健康雄性SD大鼠，SPF级，10只体质量100～120 g和105只体质量250～280 g ，从北京斯贝福公司购买，许可证号为scxk(京)2019-0010 。动物饲养在标准条件下(约24 ℃温度和48% 湿度)，术前12 h禁食不禁水。

1.1.2试剂与仪器 含EDTA的0.25%胰酶和α-MEM培养基购自美国Gibco公司；胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)购自澳大利亚Bovogen公司；FITC-CD90、PE-CD29、PE-CD45抗大鼠流式抗体购自美国Biolegend公司；抗微管相关蛋白-2(microtubule associated protein-2，MAP-2)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)、生长相关蛋白-43(growth associated protein-43，GAP-43)和Caspase-3抗体均购自英国Abcam公司。日本NiKon倒置荧光显微镜；美国Bio-Rad ChemiDocTM成像系统 、美国Invitrogen半干式快速转印系统、BD流式细胞仪。

1.2 实验方法

1.2.1BMSCs的分离与鉴定 选取体质量100～120 g的SD大鼠，用颈椎脱臼法处死后立即用75%乙醇浸泡10 min，分离出完整的股骨和胫骨，PBS溶液冲洗后，再浸入完全培养基(10% FBS、α-MEM培养基、青-链霉素)中，剪去两端的干骺端，用无菌注射器吸取培养基反复冲洗骨髓腔，直到骨髓腔变白。离心、弃掉上清液，用完全培养基以106/ml的细胞浓度接种于培养瓶中，置37 ℃、5% CO2恒温培养箱中静置培养。3 d后半换液，5 d后全换液，每隔2 d换一次液。当细胞生长达到90%融合时即可传代，传至第3代用于后续实验。

1.2.2流式细胞仪鉴定BMSCs 选择生长达90%的P3代BMSCs，用PBS制成细胞浓度为1×107/ml的单细胞悬液。从细胞悬液中分别吸取100 μl至4支无菌EP管中，分别加入FITC-CD90、PE-CD29、PE-CD45流式抗体和PBS各1 μl，各管混匀后在冰上避光孵育30 min；用PBS重悬，混匀后避光置于冰上，用流式细胞仪进行检测。

1.2.3大鼠大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型的建立 改良的Zea Longa线栓法建立MCAO模型：大鼠腹腔麻醉，切开颈动脉中线，显露左侧的颈总动脉(common carotid artery，CCA)、颈内动脉(internal carotid artery，ICA)和颈外动脉(external carotid artery，ECA)，剥离动脉鞘，仔细分离CCA、ICA与迷走神经；用动脉夹短暂阻断CCA和ICA，并结扎ECA远端，在ECA近端留一活结,在两线之间的血管上做一切口，将线栓插进ECA中后进入CCA，剪断ECA上的切口，轻轻地将ECA残端拉与ICA相平行，顺势插入ICA中，当达到栓线标记点时，固定住线栓。缺血2 h后拔除线栓，缝合伤口。术中保持大鼠肛温恒定在37 ℃左右。假手术组不插入线栓，其余操作与模型组相同。

1.2.4动物分组与移植程序 5分制法：0分:无神经损伤症状；1分:不能完全伸展对侧前爪 ；2分:向对侧转圈 ；3分:向对侧倾倒 ；4分:不能自发行走,意识丧失。再灌注24 h后进行评分，将评分为2～3分的大鼠纳入接下来的实验。动物分为假手术组(尾静脉注射PBS 1 ml)、MCAO组(尾静脉注射PBS 1 ml)、BMSC组(尾静脉注射含3×106个BMSCs的PBS 1 ml)，每组又分别在移植后的第3、7和14天进行神经功能评分和取材。所有注射均在MCAO模型构建术后24 h后进行，尾静脉缓慢注射。

1.2.5神经功能评分 采用mNSS评分法对移植后第3、7和14天的三组动物的运动、感觉、平衡和反射功能进行评分，如果得分的分值越高则说明神经功能的损伤情况越严重。

1.2.6TTC染色 麻醉后，取出完整脑组织，将脑组织按照2 mm厚切出6片冠状切片，将切片浸泡在2% TTC溶液中，置于37 ℃孵箱中避光孵育20 min，切片需定期翻转，以确保每片脑组织均匀暴露在染色溶液中，染色后将切片用4%多聚甲醛固定24 h，拍照。用ImageJ软件计算梗死体积。梗死体积百分率(%)=(正常侧脑组织体积-梗死侧正常脑组织体积)/正常侧脑组织体积×100%。

1.2.7免疫组织化学染色 心脏灌注取脑后，进行固定和脱水后将其进行包埋，制备出脑组织厚度为8 μm的冰冻切片。先后用1%Triton X-100和3%过氧化氢溶液处理脑片，再用血清封闭液封闭30 min，甩干；将切片在4 ℃下与GFAP抗体(兔抗，1 ∶800)孵育过夜，PBS洗涤后滴加二抗孵育1 h，PBS洗涤后用DAB显色剂孵育5 min，水洗；苏木精复染、脱水、透明，最后用中性树脂封片；光学显微镜下观察各组脑组织梗死区及周围的GFAP。

1.2.8免疫荧光染色 用1%Triton X-100、3%过氧化氢溶液和血清封闭液处理切片，再将切片在 4 ℃ 下分别与GFAP抗体(兔抗，1 ∶800)、MAP-2抗体(兔抗，1 ∶800)、Caspase-3(兔抗，1 ∶500)和GAP-43(兔抗，1 ∶800)孵育过夜，用PBS洗涤后分别选择FITC-山羊抗兔IgG和Cy3-山羊抗兔IgG避光孵育1 h，洗涤后用内含DAPI的封片液进行封片，用显微镜观察阳性细胞的表达。

1.2.9Western blot 试验 取缺血区脑组织50 mg，匀浆在500 μl含蛋白酶抑制剂的蛋白提取液中，冰上研磨后孵育30 min，离心取上清液进行蛋白定量检测。制备聚丙烯酰胺凝胶，进行电泳和PVDF转膜，转膜完成后，用5%脱脂牛奶封闭1 h，再分别将膜置于一抗(GFAP、MAP-2、GAP-43、Caspase-3和GADPH)中，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜，室温孵育二抗1 h。再次洗膜后显影。

2 结果

2.1 BMSCs培养过程中的细胞形态的变化BMSCs原代培养在第3天半换液后，可见有大量的红细胞和其他造血细胞漂浮在培养基中，隐约可见部分BMSCs贴壁生长(图1A)。在第5天全换液后，可见大量细胞集落式贴壁生长，以梭形细胞为主，呈放射状排列，伸出长短不一、粗细不均的突起(图1B)。在第7～8天左右，BMSCs不断增殖分化，细胞逐渐融合(图1C)；在第10～12天左右，细胞排列紧密，呈现旋涡式生长，达90%以上的融合度，达到传代标准(图1D)。

图1 大鼠BMSCs原代细胞的生长情况 ×100

2.2 流式检测BMSCs 表面标记物流式细胞仪检测第3代大鼠BMSCs结果显示，它们高表达CD29(+)、CD90 (+)，低表达CD45(-)。见图2。

图2 P3代BMSCs的表面抗原鉴定

2.3 大鼠神经功能评分移植前和移植后第3、7和14天的mNSS评分，假手术组均为0分，BMSC组[(13.0±0.7)、(9.8±0.8)、(8.0±0.7)、(5.2±0.5)分]与MCAO组[(13.4±0.6)、(12.2±0.8)、(10.0±0.7)、(8.2±0.8)分]比较，移植前分数最高且差异无统计学意义，而移植后均降低(F=77.65，P<0.01)，MCAO组和BMSC组移植后的mNSS评分与移植前比较，分值均下降，且随着移植时间的延长，mNSS评分逐渐降低，说明神经功能恢复越好。见图3。

图3 各组大鼠的mNSS评分

2.4 大鼠的脑梗死体积采用TTC染液对脑组织进行染色，肉眼观假手术组整个脑组织未显现出苍白区，MCAO组脑组织可见梗死侧大面积出现白色，BMSC组较少局部可见白色(图4A)，白色即梗死区域。MCAO组移植后第3、7和14天的大鼠脑组织梗死体积百分比分别为(44.9±1.2)%、(38.5±0.7)%、(28.2±0.8)%，与假手术组比较显著增高(P<0.01)，而BMSC组移植后第3、7和14天的大鼠脑组织梗死体积百分比分别为(42.0±0.8)%、(33.4±0.9)%、(19.5±0.6)%，较MCAO组降低(F=623.79，P<0.01),且随着移植时间的延长，梗死体积逐渐缩小(图4B)。

图4 各组大鼠的TTC染色和梗死体积百分比

2.5 免疫组化染色检测GFAP的表达各组移植后第7天脑组织的GFAP免疫组化染色结果见图5。GFAP组化学染色呈现放射状的形态(图5D)，在假手术组大鼠皮层区脑组织中GFAP阳性细胞数为(2.0±0.7)个，MCAO组为(6.0±1.0)个，BMSC组为(13.2±0.8)个，与MCAO组比较，BMSC组缺血区的GFAP阳性细胞增多，差异有统计学意义(F=219.64，P<0.01，图5E)。

图5 各组移植后第7天脑组织的GFAP免疫组化染色

2.6 GFAP、MAP-2、Caspase-3和GAP-43的荧光表达三组大鼠移植后第7天的脑组织切片，用GFAP、MAP-2、Caspase-3、GAP-43分别与DAPI共染，结果发现：① GFAP阳性细胞呈现星型状，关于大鼠脑组织缺血及周围区的GFAP阳性细胞数，假手术组中为(9.6±1.1)个，MCAO组为(24.0±1.6)个，BMSC组为(27.4±2.2)个，MCAO组高于假手术组，BMSC组高于MCAO组(F=155.74，P<0.01，图6)；② MAP-2阳性细胞在MCAO组[(9.2±0.8)个]低于假手术组[(22.8±1.6)个]，BMSC组[(18.8±1.3)个]与MCAO组相比较，表达上调(F=143.69，P<0.01，图7)；③ Caspase-3阳性细胞在假手术组、MCAO组、BMSC组的表达分别为(3.4±1.1)、(27.4±2.1)和(7.2±1.9)个，在假手术组中少见，在MCAO组中增多，BMSC组中其表达低于MCAO组，且差异有统计学意义(F=268.41，P<0.01，图8)；④ GAP-43阳性细胞在MCAO组[(33.8±1.3)个]中多于假手术组[(24.4±1.1)个]，而BMSC组[(44.4±1.1)个]中其表达上调，且差异有统计学意义(F=349.26，P<0.01，图9)。

图6 三组大鼠移植后第7天脑组织的GFAP免疫荧光染色

图7 三组大鼠移植后第7天脑组织的MAP-2免疫荧光染色

图8 三组大鼠移植后第7天脑组织的Caspase-3免疫荧光染色

图9 三组大鼠移植后第7天脑组织的GAP-43免疫荧光染色

2.7 Western blot检测Caspase-3、GAP-43、GFAP和MAP-2蛋白的表达Western blot结果分析：① 与假手术组比较，MCAO组脑组织高表达Caspase-3，而BMSC组在移植第7天和第14天时Caspase-3表达比MCAO组同时段下调，且差异有统计学意义(F=249.05，P<0.05)，而第3天未出现下调(图10A、B)；② 与假手术组比较，MCAO组GAP-43的表达上调，BMSC组较MCAO组也增高，差异有统计学意义(F=158.07，P<0.05)，在移植BMSCs后的第7天表达最高(图10A、C)；③ 与假手术组比较，MCAO组GFAP的表达增强，BMSC组较MCAO组也增强，差异有统计学意义(F=474.84，P<0.05，图10A、D)；④ 与假手术组比较，MCAO组MAP-2表达降低，而BMSC组脑组织在移植后第3、7和14天表达均出现上调趋势，差异均有统计学意义(F=160.25，P<0.05，图10A、E)。

图10 Caspase-3、GAP-43、GFAP和MAP-2在三组脑组织中不同时间点的表达

3 讨论

BMSCs普遍高表达CD29和CD90，低表达造血干细胞标记物CD45，这与大鼠骨髓间充质干细胞的细胞表面标志物图谱相一致[8]。BMSCs有在非造血组织中自我更新的能力，也具有向各种组织分化的多能性，即分化为脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞等中胚层细胞，除了中胚层系外，BMSCs还被证明了向神经细胞等神经外胚层谱系和肝细胞、胰腺细胞等内胚层谱系的转分化潜能，正是这种独特的分化为靶细胞的能力，突出了BMSCs在再生医学背景下的重要性。

本研究过程中发现BMSC组的大鼠的mNSS评分和脑梗死面积均低于MCAO组，说明BMSCs对脑梗死带来的神经功能损害有一定的治疗作用。另外发现梗死过程中可能存在一定的自我修复作用，因为随着时间的延长，脑卒中大鼠的神经功能得到了改善。MAP-2存在神经元的胞体和树突中，它对于脑缺血的反应比较敏感[9]。在本研究中，脑缺血时MAP-2表达减少，BMSCs移植后使其表达增强，这说明神经元系统的生长与修复的过程中，BMSCs可以通过增强MAP-2对缺血性脑卒中进行神经修复。星形胶质细胞一种标志性的特征就是GFAP蛋白，GFAP能够有效的参与到细胞骨架形成的过程中，并能够平衡张力[10]。脑缺血会使得星形胶质细胞的表达情况增强，并出现细胞增生的情况[11]。本研究中GFAP呈现星型或放射状，在脑缺血时高表达，且出现在缺血区周围，可能是在GFAP在脑缺血时反应性增多，参与自我修复过程。GAP-43是一种神经特异性的蛋白质，它维持突触稳定性和促进轴突再生的启动[12]。脑缺血时GAP-43表达增加，在缺血早期它处于病变的中心，随后在半影区表达，这表明GAP-43在组织的拯救和再生中起着早期的作用[13]，而BMSCs移植后其表达上调，说明BMSCs有可能是通过调节GAP-43来修复缺血组织的。Caspase-3的激活在神经元凋亡中起着极其重要的作用，是一种促凋亡蛋白[14]。MCAO大鼠患侧梗死区脑组织大面积组织溶解和细胞坏死，呈现缺血区的凋亡趋势，MCAO大鼠Caspase-3表达较假手术组上调，荧光染色可见Caspase-3阳性细胞数增多，这些均说明缺血性脑卒中梗死区出现神经细胞的凋亡，而BMSC组的梗死区Caspase-3阳性细胞数减少，说明BMSCs移植具有抑制神经细胞凋亡的作用。

综上所述，BMSCs治疗缺血性脑卒中有成效，表现在梗死面积减小、神经行为改善、凋亡细胞受到抑制、局部轴突再生和神经胶质细胞增生等。本研究仅为临床上治疗缺血性脑卒中提供了理论依据，要想完全阐明其神经修复机制，还需进一步研究。