保肾片超高效液相色谱指纹图谱的建立及化学模式识别分析

陆崟，李金慈，盛华，唐安福，苏华，汤淏（东部战区总医院药剂科，南京 210002）

保肾片是由蓼科植物大黄经醇提和水提等一系列工艺制成的中药制剂，为东部战区总医院肾脏科的常用制剂，在临床用药中占据重要地位。该药具有升清消浊、调节代谢的作用，通过缓解“残余肾”的高代谢状态、影响氮质代谢及肾系膜细胞增殖和功能而发挥保护肾功能的作用，临床主要用于慢性肾功能不全氮质血症期的治疗。保肾片现有质量标准是采用薄层色谱法对制剂中的大黄素进行鉴别，并结合高效液相色谱法对大黄酸、大黄素和大黄酚的总量进行测定。然而，中药是以多组分、多靶点发挥作用的，对其中某一个或某几个指标成分的控制难以全面反映其整体质量。

中药多为复杂的化学成分群，采收、加工、生产等各个环节均会对质量产生影响，而中药质量直接影响其临床疗效和用药安全。如何对复杂的中药体系进行合理的质量控制，始终是中药现代化发展过程中的热点与难点问题。中医治疗疾病的理论精髓是整体观念和辨证论治，在尚不能明确中药全部药效物质的今天，应遵循中药的用药特点、基于中药整体物质群科学地建立其特色的、系统的质量评价方法。中药指纹图谱实现了以现有分析技术为载体全面挖掘中药中的化学成分信息，目前在中药真伪鉴别、质量一致性评价等方面应用广泛，并已受到国内国际一致认可。然而完全通过人为方式辨识指纹图谱的庞大数据信息是不可能且不客观的，因此常常将化学模式识别技术与指纹图谱相结合来进行多维数据的解析。因此，本研究采用超高效液相色谱法（UPLC）首次建立了本院制剂保肾片的指纹图谱，通过相似度评价对保肾片的质量稳定性进行整体评价，通过聚类分析（CA）和正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）寻找不同批次样品间的差异，为综合评价制剂质量、提升质控标准提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1290 InfinityⅡ 型UPLC仪，配 备G7117B DAD检测器、OpenLAB CDS ChemStation工作站（美国安捷伦科技公司）；AE240型电子天平（梅特勒-托利多）；HH-4型数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）；GM-0.33A型真空泵、0.45 μm针头过滤器（天津津腾科技有限公司）。

1.2 试药

没食子酸（批号：110831-201204，含量：89.9%）、大黄素（批号：110756-201512，含量：98.7%）、大黄酚（批号：110796-201621，含量：99.2%）、大黄素甲醚（批号：110758-201013，含量：99.8%）、芦荟大黄素（批号：110795-201308，含量：98.0%）（对照品，中国食品药品检定研究院）；甲醇为色谱纯（美国Tedia公司），冰醋酸为分析纯（上海申博化工有限公司），超纯水为实验室自制。16批保肾片（规格：0.3 g/片自制，编号S1～S16，批号分别为20200116、20200224、20200325、20200420、20200514、20200602、20200611、20200626、20200710、20200805、20200901、20200925、20201015、20201029、20201117、20201216），各批次制剂所用饮片来源见表1。

表1 原料饮片样品信息
Tab 1 Information of raw herbal materials

编号 厂家 批号 基源 产地S1 华云药业 190901 药用大黄 青海S2 华云药业 190901 药用大黄 青海S3 华云药业 191001 药用大黄 青海S4 华云药业 191001 药用大黄 青海S5 华云药业 191001 药用大黄 青海S6 华云药业 191201 药用大黄 青海S7 华云药业 191201 药用大黄 青海S8 华云药业 191201 药用大黄 青海S9 华云药业 191201 药用大黄 青海S10 华云药业 191201 药用大黄 青海S11 北川华宁 200706 药用大黄 甘肃S12 北川华宁 200706 药用大黄 甘肃S13 北川华宁 200706 药用大黄 甘肃S14 北川华宁 200706 药用大黄 甘肃S15 南京鹤龄 191101 唐古特大黄 青海S16 南京鹤龄 191101 唐古特大黄 青海

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色 谱 柱：Agilent Por oshell 120 EC-C（2.7 μm，4.6 mm×50 mm）；流动相：甲醇（A）-0.2%冰醋酸水溶液（B），梯度洗脱（0～6.0 min，6%～20%A；6.0～15.0 min，20%～40%A；15.0～28.0 min，40%～60%A；28.0～33.0 min，60%A；33.0～36.0 min，60%～100%A；36.0～39.0 min，100%A）；流速0.8 mL·min；柱温30℃；进样量1 μL；检测波长260 nm。

2.2 溶液制备

2.2.1 供试品溶液 取本品20片，去薄膜衣，研细，精密称取0.5 g置圆底烧瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，水浴加热回流1 h，取出放冷，再次称定质量，甲醇补足减失质量，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.2.2 对照品溶液 精密称取没食子酸、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量，置于量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成含没食子酸50.55 μg·mL、芦荟大黄素51.30 μg·mL、大黄素51.75 μg·mL、大黄酚59.55 μg·mL、大黄素甲醚68.40 μg·mL的混合对照品溶液，4℃储存备用。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取S1号样品，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，连续进样6次，以峰面积较大、分离度较好的3号峰为参照，结果12个共有峰相对保留时间

RSD

为0.010%～0.11%、相对峰面积

RSD

为2.3%～2.8%，表明仪器精密度良好。2.3.2 稳定性试验 取S1号样品，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，于0、1、2、4、8、12、24 h进样分析，记录色谱图。以3号峰的保留时间和峰面积为参照，结果12个共有峰相对保留时间

RSD

为0.010%～0.20%、相对峰面积

RSD

为1.8%～2.4%，表明供试品溶液在室温条件下24 h内稳定性良好。2.3.3 重复性试验 取S1号样品6份，按“2.2.1”项下方法平行制备供试品溶液，进样分析，记录色谱图，以3号峰为参照，结果12个共有峰相对保留时间

RSD

为0.011%～ 0.18%、相对峰面积

RSD

为0.87%～1.1%，表明方法重复性良好。

2.4 指纹图谱的建立及分析

分别取S1～S16号保肾片，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，进样分析。采用“中药指纹图谱相似度评价系统（2012A版）”软件进行色谱图数据的分析处理，以S1号样品图谱为参照，时间窗宽度设为0.1 s，采用中位数法生成对照图谱R，经多点校正后全谱峰匹配建立指纹图谱，结果见图1。共确定了12个共有峰，共有峰峰面积之和占色谱图总峰面积的81.11%，符合要求。取“2.2.2”项下对照品溶液进样分析，根据保留时间和紫外吸收光谱进行对比，指认出12个共有峰中的5个，分别为1号峰（没食子酸）、9号峰（芦荟大黄素）、10号峰（大黄素）、11号峰（大黄酚）、12号峰（大黄素甲醚），见图2。

图1 16批保肾片的UPLC指纹图谱Fig 1 UPLC fingerprints of 16 batches of Baoshen tablets

图2 混合对照品色谱图（A）与对照图谱R（B）Fig 2 UPLC chromatogram of mixed reference substances（A）and control fingerprint R（B）

根据“中药指纹图谱相似度评价系统（2012A版）”计算得出S1～S16号保肾片样品与对照指纹图谱的相似度在0.860～0.997，具体结果见表2，其中14批样品的相似度均大于0.9，表明不同批次保肾片相似度较高，制剂工艺较稳定。S15、S16两批保肾片的相似度相对较低，可能与原料药材不同有关。

表2 16批保肾片相似度评价结果
Tab 2 Similarity evaluation of 16 batches of Baoshen tablets

?

以3号峰为参照峰（S峰），计算16批样品中各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果各批样品的相对保留时间

RSD

为0.060%～0.65%，波动极小，但相对峰面积

RSD

为14%～110%，波动较大，表明不同批次保肾片中共有成分的含量存在差异。

2.5 化学模式识别分析

2.5.1 CA 以共有峰峰面积与样品取样量的比值作为变量建立数据矩阵，导入SPSS 25.0统计软件，以平方欧氏距离为度量标准，采用组间联接法进行系统聚类，结果见图3。由树状图可知，类间距为5～10时样品可分为两类，第一类样品为S1～S10，相似度均大于0.99，第二类样品为S11～S16，相似度相差较大，说明16批保肾片整体质量基本稳定，但因原料饮片来源不同导致各批次制剂的共有成分存在差异。

图3 16批保肾片的CA结果Fig 3 Cluster analysis of 16 batches of Baoshen tablets

2.5.2 OPLS-DA 由上述CA分析和相似度分析结果可知，不同批次保肾片样品之间存在一定差异。为了进一步明确16批保肾片之间的差异，将“2.5.1”项下数据矩阵导入Simca-P14.1多元统计软件，对样品共有峰聚类所得的两大类进行OPLS-DA分析。由图4可知，样品分组区分良好，当提取2个主成分时，模型主成分回归系数为：

RX

＝0.893，

RY

＝0.998，

Q

＝0.994，均高于0.5，且差距小于0.2，说明所建模型有效，且有较高的稳定性和预测能力。由载荷图（见图5）可看出11号、4号和3号色谱峰距离中心的离散程度较高，说明这几种成分对保肾片制剂的质量稳定性影响较大。变量重要性投影值（variable importance in projection，VIP）可直观反映各变量对模型分类的整体贡献度，当VIP＞1.0时表明该色谱峰为具有统计学意义的差异标志物。由图6可知，VIP值大于1.0者为峰11（VIP＝2.1746）、峰4（VIP＝2.0980）、峰3（VIP＝1.1045），提示这3种成分对不同批次保肾片的质量一致性具有显著影响，在生产过程的质量控制中可重点关注它们的变化情况。

图4 16批保肾片OPLS-DA得分图Fig 4 OPLS-DA score plot of 16 batches of Baoshen tablets

图5 16批保肾片OPLS-DA载荷图Fig 5 OPLS-DA loading plot of 16 batches of Baoshen tablets

图6 16批保肾片OPLS-DA变量重要性投影图Fig 6 OPLS-DA VIP plot of 16 batches of Baoshen tablets

2.6 指标成分含量测定

按文献方法对16批样品中大黄酸、大黄素、大黄酚的含量进行测定，结果见表3和图7。由结果可看出，各批次样品中大黄酸的含量差异较大，其余两种成分的含量存在波动，结果与OPLS-DA相一致，这可能是原料饮片厂家更换所导致。

图7 指标成分含量测定折线图Fig 7 Content determination of index components

表3 保肾片中大黄酸、大黄素、大黄酚的含量测定结果(mg/片)Tab 3 Content of rhein，emodin and chrysophanol in Baoshen tablets (mg/slice)

编号 大黄酸 大黄素 大黄酚 3种成分总量S1 0.07 0.99 4.06 5.12 S2 0.08 0.92 3.82 4.82 S3 0.09 1.07 4.18 5.35 S4 0.09 1.07 4.10 5.26 S5 0.07 1.24 5.66 6.98 S6 0.14 1.06 4.61 5.81 S7 0.05 0.59 2.48 3.12 S8 0.14 1.06 4.61 5.81 S9 0.19 0.82 3.18 4.18 S10 0.30 1.15 5.05 6.49 S11 0.37 1.30 5.23 6.90 S12 1.01 1.67 5.77 8.45 S13 1.20 1.99 5.69 8.88 S14 1.09 1.82 6.13 9.04 S15 2.21 1.56 4.80 8.58 S16 2.18 1.47 4.70 8.34

3 讨论

本研究采用UPLC建立保肾片的指纹图谱，与普通液相色谱法相比，具有分离度更高，检测更灵敏，分离时间更短的优势。在文献研究基础上，以色谱图的出峰数和峰面积为指标，对保肾片的提取条件（提取溶剂、提取方法、回流时间）进行了考察，结果显示以甲醇为溶剂水浴加热回流1 h所获得的供试品溶液色谱峰最多且响应值较高。通过调整流动相的组成和洗脱梯度，比较不同流速（0.8、1.0、1.2 mL·min）、不同柱温（25、30、35℃）、不同波长（254、260、280 nm）条件下的分离分析效果，发现在本文色谱条件下所获得的色谱图基线更平稳、色谱峰信息更全面、峰形与分离度俱佳。

指纹图谱提供的信息庞大而复杂，需要采用合理的数据挖掘工具对其进一步解析，化学模式识别技术则可有效解决这一问题，具有良好的预测性和广泛的适用性。常用的化学模式识别方法分为聚类分析（CA）、主成分分析（PCA）等无监督模式识别和OPLS-DA、线性判别分析等有监督模式识别两种，它们不仅可单独使用，还可结合在一起用于中药质量控制。本文将CA与OPLS-DA相结合用于保肾片指纹图谱数据挖掘。

本研究通过相似度分析发现16批保肾片指纹图谱相似度在0.860～0.997，12个共有峰的相对保留时间高度吻合（

RSD

小于0.65%），说明该制剂的指纹图谱稳定可靠。CA发现16批保肾片可以分为两类，S1～S10聚为一类，S11～S16聚为一类，说明更换原料药材厂家对制剂质量的均一稳定性产生了一定的影响。为了明确差异所在，进一步采用OPLS-DA进行筛选，得到了峰3、峰4、峰11显著性差异成分3种，其中11号峰为大黄酸，3号峰和4号峰未能与对照品比对，后期需通过质谱等技术进一步研究。通过对保肾片指标性成分进行含量测定，发现各批次样品中大黄酚的含量差异较大，这与OPLS-DA结果相一致。大黄是一种典型的多基原、多产地药材，《中国药典》2020年版中收载的正品大黄为蓼科植物掌叶大黄

Rheum palmatum

L.、唐古特大黄

Rheum tanguticum

Maxim

. ex

Balf

.

或药用大黄

Rheum officinale

Baill

.

的干燥根和根茎。大黄对生长环境要求较为严苛，其生长过程中的温度、湿度、光照、遗传、土壤状态、采收时间等因素均会影响药材质量。已有研究表明药用大黄和唐古特大黄亲缘关系较近，指纹图谱CA和PCA均不能将其区分开，但指标成分含量测定结果显示唐古特大黄中游离型蒽醌与结合型蒽醌的总含量均高于其他大黄品种。本研究中发现保肾片制剂原料饮片更换后对制剂质量产生了一定的影响，大黄酸、大黄素、大黄酚总量均大于3.0 mg/片，整体上符合当前质量标准的要求，但大黄酸的含量差异较大，S15、S16的原料药材来源于唐古特大黄，大黄酸含量显著高于其他批次保肾片。由此可见现有的质量标准尚不能完全体现保肾片生产全过程的质量稳定性，若将含量测定与指纹图谱相结合，可更全面、客观地表征药物信息及工艺稳定性。

综上所述，本试验建立了保肾片的UPLC指纹图谱，分析方法稳定可靠、简便易行、高效快速，进一步结合CA和OPLS-DA对指纹图谱进行综合评价，可较全面地反映制剂的整体信息和特征信息，为保肾片制剂质量控制的改善和标准的提高提供了科学依据。