全自动二维液相色谱法测定甲氨蝶呤血药浓度及其临床应用

刘加涛，孙小珊，宋帅，苏涌，夏泉（安徽医科大学第一附属医院药剂科，合肥 230032）

甲氨蝶呤（MTX）是一种抗叶酸药物，通过抑制叶酸生物合成中的关键酶二氢叶酸还原酶发挥活性，广泛用于类风湿关节炎、白血病、淋巴瘤、骨肉瘤等疾病。MTX血药浓度升高可能导致MTX毒性风险增加，包括肾毒性、中枢神经毒性、皮肤毒性、胃肠道毒性、血液学毒性、肝毒性和肺毒性，充分水化和碱化尿液可以减少这些不良反应的发生率。MTX不良反应的发生频率和严重程度与给药途径和血药浓度有关，大多数毒性作用与血药浓度有关，并且如果能早期发现并进行亚叶酸钙解救治疗通常是可逆的。MTX治疗（尤其是高剂量时）的不良反应发生率高，患者个体间的药代动力学和药效学变化大，需要对MTX进行常规监测，以指导亚叶酸类似物的解救治疗方案，降低MTX毒性反应。

MTX的监测方法有多种，早期的分析方法虽然灵敏度高，但是耗时耗力并要求使用放射性同位素；而使用抗体的生物分析方法，如放射免疫分析、荧光偏振免疫分析和酶放大免疫测定法，虽具有操作简单、检测速度快和成本低等多种优势，但由于MTX与其代谢物之间潜在的抗体交叉反应，导致结果的准确性和特异性降低。此外，采用串联质谱（MS-MS）检测MTX的方法虽具有灵敏度高、准确性好等优点，但质谱相关设施昂贵，操作要求较高，医院难以常规配备。因此，本研究旨在建立一种简单、快速、特异、灵敏的MTX血药浓度测定的全自动二维高效液相色谱（2D-LC）法，并在使用MTX治疗的患者的常规药物浓度监测中进行初步验证。

1 仪器与试药

1.1 仪器

2D-LC-UV系统由FLC全自动二维液相色谱耦合仪（湖南德米特仪器有限公司）及岛津LC-20A液相色谱部件构成，FLC连接第一维色谱泵、第二维色谱泵、检测器、自动进样器等色谱模块；其中第一维色谱系统（LC1）完成样品富集及一维分离，第二维色谱系统（LC2）完成进一步分离检测，两维系统通过智能流路控制系统（TRS）连接，采用“中心切割”模式转移目标物，中间转移柱同时承担转移、拦截杂质的功能，工作站为Lab Solution 工作站，具体结构示意图见图1。BT25S电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；HC-3018R型高速冷冻离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；KDC-1044型低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；涡旋混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）。

图1 全自动二维液相色谱工作原理示意图Fig 1 Schematic diagram of 2D-LC system

1.2 试药

甲氨蝶呤对照品（批号：079K1241，Sigma公司，纯度：99.9%）；甲醇、乙腈（色谱纯，ACS）；磷酸、磷酸铵、三氟乙酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；ACP-1去蛋白剂、ACG保护剂（湖南德米特仪器有限公司），灭菌注射用水（四川科伦药业有限公司），空白马血清（批号：113I051，北京索莱宝科技有限公司）。

2 方法

2.1 色谱条件

第一维色谱系统中，采用Aston SC2（C，4.6 mm×25 mm，5 μm）柱，流动相为MVV-1D移动相，流速0.6 mL·min；采用Aston SN中间柱（苯基柱，4.6 mm×10 mm，5 μm），流动相为纯水。第二维色谱系统中，采用Aston SX1柱（氰基柱，4.6 mm×75 mm，5 μm），流速1.0 mL·min，柱温40℃，紫外检测波长304 nm，等度洗脱，进样量400 μL。

2.2 对照品溶液的配制

精密称取甲氨蝶呤对照品4.54 mg置于2 mL量瓶中，加入适量色谱甲醇充分溶解并定容，配制成5.0 mmol·L的MTX储备液，置于－80℃，备用。

2.3 质控品溶液的配制

取“2.2”项下对照品溶液0.2 mL，稀释至1.0 mL，混匀，得1.0 mmol·L的MTX工作液。取1.0 mmol·L的MTX工 作 液0.2 mL，加入空白马血清20 mL，混匀，得高浓度质控品溶液（10.0 μmol·L）。依次配制中浓度（5.0 μmol·L），低浓度（0.10 μmol·L）质控品溶液，于－20℃冰箱备用。

2.4 样品处理

采集使用甲氨蝶呤治疗的患者的静脉血2 mL，以3000 r·min离心5 min。取血浆200 μL至1.5 mL EP管中，加入ACP-1去蛋白剂600 μL，涡旋混匀2 min，用高速冷冻离心机4℃下12 000 r·min离心10 min。取上清液，同样条件下再次离心，取600 μL上清液至1.5 mL进样瓶中，再加入60 μL ACG保护剂，震荡摇匀，即得。

2.5 方法学验证

2.5.1 线性关系考察 取1.5 mL EP管若干，分别加入空白血清191.2 μL，然后加入系列浓度的甲氨蝶呤工作溶液各8.8 μL，按照“2.4”项下方法处理，即得12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1和0.05 μmol·L的血浆样品，进样测定，以峰面积对浓度进行线性回归，计算回归方程。

2.5.2 回收率和精密度 平行制备0.1、5.0、10.0 μmol·L的低、中、高MTX含药血浆样品，按“2.4”项下方法进行样品预处理，进样测定，计算MTX浓度。均平行操作5次，计算回收率；且每个样品均在24 h内重复测定5次，计算日内

RSD

；连续测定3 d，计算日间

RSD

。

2.5.3 稳定性考察 平行制备浓度分别为0.1、5.0、10.0 μmol·L的MTX含药血浆样品，按“2.4”项下方法进行预处理，分别考察其室温放置24 h、－20℃反复冻融3次和－20℃保存2周后MTX的稳定性。

2.6 样本

收集2019年10月28日—2020年12月17日某院接受甲氨蝶呤治疗的24例患者的48份血样，其中男性患者16例，女性患者8例，平均年龄是（24.4±23.8）岁（2～71岁），按照“2.3”项下方法处理后进样检测。

3 结果

3.1 系统适应性及专属性考察

分别取空白血浆、含MTX对照品血浆和患者血浆样品，按照“2.4”项下方法处理样品，进样检测。结果显示，MTX的出峰时间为7.24 min，并且在MTX出峰位置无内源性物质干扰，专属性较好，见图2。

图2 甲氨蝶呤二维液相色谱图Fig 2 2D-LC chromatogram of methotrexate

3.2 线性关系考察

以甲氨蝶呤峰面积为

Y

，血浆浓度为

X

，通过最小二乘法进行线性回归，得甲氨蝶呤回归方程为：

Y

＝7.416×10＋4.243×10（

r

＝0.9997），表明甲氨蝶呤在0.05～12.8 μmol·L与峰面积线性关系良好，最低定量限为0.05 μmol·L。

3.3 精密度试验

据“2.5.2”项下方法检测低、中、高3个浓度甲氨蝶呤的日内精密度的

RSD

值分别为4.7%、1.6%和3.5%，均低于5.0%；日间精密度的

RSD

值分别为5.9%、2.2%和5.7%，均低于10.0%，表明仪器精密度良好。

3.4 回收试验

根据“2.5.2”项下方法测定得到0.1、5.0和10.0 μmol·L样品的回收率分别为（94.61±5.6）%、（99.17±1.7）%和（103.99±3.5）%，

RSD

均小于10.0%，表明该方法的回收率较高，符合生物样品分析要求。

3.5 稳定性考察

根据“2.5.3”项下方法考察稳定性发现甲氨蝶呤在室温、－20℃反复冻融和长期冻存后浓度的

RSD

值分别在0.40%～5.9%、0.35%～2.0%和1.2%～2.2%，各浓度组的

RSD

均小于6.0%，表明甲氨蝶呤在上述条件下稳定。

3.6 甲氨蝶呤血药浓度测定

对24例患者使用MTX治疗的患者的48份样本进行检测，结果发现72.9%（35/48）的MTX样本药物浓度均在标准曲线范围内，另有16.7%（8/48）的样本因患者使用大剂量MTX后0或24 h 浓度超出正常值上限，0 h浓度最高可达到600.26 μmol·L（392.3～600.26 μmol·L），24 h MTX血浓度最高可达到73.34 μmol·L（1.33～73.34 μmol·L）。此外，本研究中有10.4%（5/48）的样本因患者使用低剂量治疗类风湿关节炎而未检出MTX。随着时间推移，患者血浆MTX浓度显著下降，用药后48 h后83.3%（15/18）的患者MTX浓度低于1.0 μmol·L，用药72 h后约88.89%（16/18）的患者MTX浓度低于0.1 μmol·L。

4 讨论

长期以来，基于药代动力学指导下的亚叶酸钙治疗是解救危及生命的MTX相关毒性的关键。多数研究发现，如果延迟给予亚叶酸钙将达不到解救治疗的效果，而高剂量的MTX需要不成比例的亚叶酸钙解救，这表明亚叶酸钙的解救时间和剂量必须以监测MTX水平为基础。MTX治疗后接受解救治疗的最佳时机尚不清楚，最初研究提示血清水平低于0.05 μmol·L之前均需要给予支持治疗。研究表明，在MTX用药后42～48 h，血药浓度在0.20～0.90 μmol·L范围内可停止亚叶酸钙解救治疗，而72 h时的 MTX浓度应低至0.10 μmol·L。另有研究发现，对于肾功能正常的患者，当MTX水平为0.1 μmol·L时，可以停用甲酰四氢叶酸。为安全起见，本研究纳入的患者均采用0.1 μmol·L作为解救治疗的阈值，并发现约88.89%（16/18）的患者在用药结束后72 h血浆MTX浓度低于0.1 μmol·L，所有患者均未发生严重的毒副作用。

本研究建立测定MTX浓度的2D-LC法，具有稳定性好、灵敏度高的特点，最低定量限可达到0.05 μmol·L，不仅可以满足大剂量MTX化疗后亚叶酸钙解救的需要，而且可用于部分使用MTX治疗类风湿关节炎及小儿白血病患者的MTX血药浓度监测，可更好地为临床医师提供安全用药参考。

2D-LC是近年来发展起来的新型液相色谱技术，已经成为药物分析中的重要手段之一。2D-LC是由两种不同分离机制的色谱技术提供的不同保留机制的组合，显著提高了分析的敏感性。本研究使用的2D-LC采用自动中间柱作为转移接口，不仅具有捕获和传递的功能，而且还具有拦截的功能，使分析物从共洗脱混合物中分离出来。与其他液相色谱系统相比，该系统具有样品前处理简单，色谱柱平衡时间短（通常10 min平衡完毕），测定完成后色谱柱无需清洗以及流动相可以长期放置（商业化试剂已事先灭菌和密封）等诸多优点。这些技术大大节省了治疗药物监测工作中的仪器准备和维护时间，增加了血药浓度检测的时效性。此外，本试验中采用特异性的ACP-1去蛋白沉淀剂，可有效去除杂质成分，加入的保护剂不仅可稳定药物，还可对色谱柱起到保护作用。

总之，本文所建立的方法操作简单、稳定性和重复性好，能满足临床报告及时性、准确性等要求，有助于医师根据患者的MTX血药浓度预先判断不良反应并及时对治疗进行调整，保证患者用药安全有效，提高个体化用药水平。