两种菌种保藏方法对金黄色葡萄球菌抗力影响的研究*

杨春晓,方艳梅,黄辉涛,林毅雄

广东省珠海市疾病预防控制中心,广东珠海 519060

菌种的科学保藏和管理直接关系到微生物资源的保存和利用,选择最适宜的保藏方法,可保证微生物在保藏和传代过程中免于变异、衰退、活力减弱及死亡[1]。菌种保存,无论是标准菌株传代保存还是有效保存新分离菌株,都是细菌学检验、教学科研机构及有关生产单位的重要工作之一[2]。在保存菌种的过程中,除了保证菌株存活外,还应该在保存过程中保持其固有的各种生物性状及抗原特性。应针对不同的菌株确定适宜的保藏方法,同一菌株应选用两种或者两种以上方法进行保藏[3-5]。传统保藏菌种的方法较多,其中公认最好的方法是冷冻真空干燥保藏法[6-9]。而菌种保藏管法是近年来使用较多的新型保存方法[10],是用一种商品化的菌种保藏管中的瓷珠保存菌种,由于操作方便和实用性强倍受大家青睐,为微生物菌种保藏提供了新的方式[11]。基于此,本文通过杀菌试验对冷冻真空干燥保藏法和菌种保藏管法保存的金黄色葡萄球菌抗力进行研究,以探讨两种菌种保藏方法的保存效果。

1 材料与方法

1.1 材料 试验菌株为金黄色葡萄球菌标准菌株(ATCC6538),由广东省微生物菌种保藏中心提供,经复苏培养后保种。菌种分别用以下两种保存方法进行保存:冷冻真空干燥保藏法4 ℃保存和菌种保藏管法-80 ℃保存。试验用消毒剂为某品牌速干手消毒液(以下简称消毒液),主要成分为0.10%～0.14%过氧化氢和72%～82%乙醇。

1.2 方法

1.2.1 试验菌悬液制备 从第1 支菌种保藏管(-80 ℃保存6个月)中取出1粒瓷珠,加入适量营养肉汤,37 ℃培养24 h,用10 μL 一次性接种环挑取一环划线接种于营养琼脂平板,37 ℃培养24 h,挑取平板中单个典型菌落,接种于营养琼脂斜面,37 ℃培养24 h,取新鲜斜面培养物,用0.3 mol/L 磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗下斜面上的菌苔,将其稀释配制成浓度为1×108～9×108cfu/mL试验菌悬液。按相同方法从第2支菌种保藏管(-80 ℃保存1年)和第3支菌种保藏管(-80 ℃保存3年)分别取出瓷珠制成试验菌悬液。

用2 mL PBS溶解第一瓶用冷冻真空干燥保藏法保存的冻干粉(4 ℃保存6个月),待完全溶解分散后混匀,加入适量营养肉汤,37 ℃培养24 h,用10 μL一次性接种环挑取一环划线接种于营养琼脂平板,37 ℃培养24 h,挑取平板中单个典型菌落,接种于营养琼脂斜面,37 ℃培养24 h。按上述的方法配制成1×108～9×108cfu/mL 试验菌悬液。取第2瓶冻干粉(4 ℃保存1年)和第3瓶冻干粉(4 ℃保存3年),按同法制成试验菌悬液。

1.2.2 中和剂鉴定试验 试验设定8个试验组[12],按照中和剂鉴定试验的要求进行操作。第1组为试验结果为无试验菌,或有极少数试验菌菌落生长;第2组的试验菌菌落较第1组多,但较第3、4、5组少;第3、4、5组试验菌菌落生长量相似,其组间误差率不超过15%;第6～8组无菌落生长。试验重复3次。

1.2.3 杀菌试验 在无菌试管内加入0.5 mL 试验菌悬液和0.5 mL小牛血清,再加入4 mL消毒液(对照组用PBS 代替),迅速混匀,盖严试管塞后作用3 min,立即吸取0.5 mL混合液转移至盛有4.5 mL中和剂的试管中,迅速混匀。作用10 min后作适当稀释,然后取其中2～3个稀释度,分别吸取0.5 mL,置于两个灭菌平皿中,倾注40～45 ℃的营养琼脂培养基15～20 mL,转动平皿使其充分均匀,琼脂凝固后翻转平皿,37 ℃培养48 h,进行活菌计数,计算杀菌率。试验重复5次。

1.3 统计学处理 采用Microsoft Excel软件建立数据库,采用SPSS25.0软件进行统计分析。计数资料采用百分数表示,组间比较采用Kruskal-Wallis 检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 中和剂鉴定试验结果 试验结果表明,以含0.1%硫代硫酸钠及30 g/L 吐温-80的营养肉汤作为中和剂,可以起到有效中和试验中过氧化氢和乙醇的作用,且中和产物对试验菌生长及培养基无影响,见表1。

表1 消毒液中和剂鉴定的平均回收菌落数(cfu/mL)

2.2 菌种保藏管法对金黄色葡萄球菌的杀菌试验结果 结果表明,消毒液作用3 min,对菌种保藏管中保存6个月的金黄色葡萄球菌杀菌率为99.076%;对菌种保藏管中保存1 年的金黄色葡萄球菌杀菌率为99.193%;对保存3 年的金黄色葡萄球菌杀菌率为99.968%。由此可见,随着菌种保藏管保存时间的延长,杀菌率明显升高,差异有统计学意义(H=12.020,P=0.002)。见表2。

表2 菌种保藏管法对金黄色葡萄球菌的杀菌试验结果

2.3 冷冻真空干燥保藏法对金黄色葡萄球菌的杀菌试验结果 结果表明,消毒液作用3 min,对冷冻真空干燥保藏法保存6个月的金黄色葡萄球菌杀菌率为99.025%;对冷冻真空干燥保藏法保存1年的金黄色葡萄球菌杀菌率为99.039%;对保存3年的金黄色葡萄球菌杀菌率为99.063%。由此可见,随着冷冻真空干燥保藏法保存时间延长杀菌率略有增加,但差异无统计学意义(H=0.666,P=0.717)。见表3。

表3 冷冻真空干燥保藏法对金黄色葡萄球菌的杀菌试验结果

3 讨论

菌种的保藏工作是十分重要的工作,成功进行菌种保藏是利用微生物的先决条件,是良好的实验室管理和实验质量的重要保证[13]。保存菌种的方法很多,总的来说可以分成两大类[14]:一类是保存生长在培养基上的菌种培养物,通过控制培养条件延长菌种的存活期;另一类保存方法是除去培养基后保存菌体细胞,利用低温、干燥、无营养和隔绝空气等条件,使菌体细胞生命活动降至最低,处于“休眠”状态,从而延长菌种的保存时间。菌种保藏管法和冷冻真空干燥保藏法均属于后者。本文采用含有效成分为过氧化氢和乙醇的消毒液对不同保存条件下金黄色葡萄球菌的杀菌率进行研究,杀菌率越高,菌株的抗力越小。本研究结果表明,在菌种保藏管法中,随着保存时间的延长,金黄色葡萄球菌抗力下降明显;而在冷冻真空干燥保藏法中,随着保存时间延长,金黄色葡萄球菌抗力未见明显变化,说明不同菌种保藏方法对金黄色葡萄球菌抗力影响不同,冷冻真空干燥保藏法对金黄色葡萄球菌抗力影响较小,故认为需要长时间保存金黄色葡萄球菌首选冷冻真空干燥保藏法。但冷冻真空干燥保藏法操作技术难度大,需要特殊设备,由于基层微生物实验室普遍缺乏菌种冻干机,无法采用此法保存菌株。菌种保藏管法即瓷珠菌种保存管法,常用于食品微生物标准菌种和分离菌株的保存、复苏以及运输[15]。菌种保藏管法虽然保存效果次于冷冻真空干燥保藏法,但其在规定的期限内具有良好的菌株保存效果,这种方法对实验室条件要求不高,同时具有方便经济、操作简便等优点,较好地满足了工作需求,对基层微生物实验室来说较适用,易于推广。

王凯[16]研究了斜面低温、半固体穿刺法、液体石蜡法和冷冻干燥法保存金黄色葡萄球菌的效果,通过分析不同保存时间的细菌存活率,认为冷冻干燥法保存金黄色葡萄球菌的效果较好,保存时间长,且不影响菌株的形态和生化结构。罗成富[17]通过对不同菌种保藏方法保存的常见葡萄球菌成活率进行比较,得出冷冻干燥法是保藏常见葡萄球菌的最佳方法,值得推广。贾兴真等[18]研究了84消毒液作用于经反复冻融后的金黄色葡萄球菌的杀菌率,结果显示用菌种保藏管保存的菌株抗力未见显著变化。而本文通过杀菌试验研究两种不同的菌种保藏方法对金黄色葡萄球菌抗力的影响,结果表明冷冻真空干燥保藏法保存效果更理想。

菌种保存温度越低,微生物的代谢越不活跃,生物活性越稳定[19]。但本研究结果表明在超低温条件下菌种保藏管瓷珠的保存效果不如在普通低温条件冷冻真空干燥保藏法的冻干粉。采用冷冻真空干燥保藏法-80 ℃保存菌株效果如何,其对消毒液的抗力变化情况仍需进一步研究。

综上所述,冷冻真空干燥保藏法保存金黄色葡萄球菌的效果优于菌种保藏管法。工作人员应根据实验室的具体条件和工作的实际要求选择一种行之有效的菌种保藏方法,以保证实验室质量控制、日常检验和科学研究等顺利开展。