芝麻素对大鼠骨质疏松症的作用研究

马忠平 叶楠 张志峰 杨毅峰 杨云

内蒙古医科大学第二附属医院关节外科，内蒙古 呼和浩特 010030

骨质疏松症(osteoporosis, OP)是最常见的骨骼疾病, 是一种以骨量低，骨组织微结构损坏，导致骨脆性增加，易发生骨折为特征的全身性骨病[1]。骨质疏松症通常无症状或轻微，是临床病理性骨折的常见原因，也是影响人类健康高危因素之一[2]。相关研究[3-4]报道，世界范围内，骨质疏松症在超过50岁人群中的影响率为15%，在80岁以上的人群中其影响率为70%。骨质疏松症的患病人群中，2%～8%的男性和9%～38%的女性受到骨质疏松症及相关并发症的严重影响[5]。目前全世界近5 000万人患有骨质疏松症，超过1 800万人骨量低于正常，形成了庞大的骨质疏松症的高危人群[4]。近期研究[6-7]指出，遗传因素、生理、环境和生活方式对骨量均有重要影响，手术切除卵巢、酒精中毒、甲状腺机能亢进、厌食症、肾脏疾病等多种疾病可以诱发骨质疏松症，另外，化疗、抗癫痫药物、质子泵抑制剂、糖皮质激素药物和选择性5-羟色胺再摄取抑制剂等一些药物也可以引起骨质疏松症。骨质疏松症其发病相关分子机制尚未明确，临床表现及预后均较为复杂，且病程迁延，尚未有有效治疗方法。

芝麻素是从花椒植物的表皮和芝麻油中分离得到的一类木脂素，通常被用作膳食减脂补充剂。其主要代谢产物是肠内酯，半衰期小于6 h。芝麻素是芝麻油的次要成分，平均仅占芝麻油总重量的0.14 %[8-9]。Orawan等[10]证实芝麻素可以通过激活p38和ERK/MAPK途径来触发人类胎儿成骨细胞和人类脂肪来源干细胞的成骨分化。相关研究指出，芝麻素通过调节Wnt/b-catenin信号通路可以促进大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，其对重塑大鼠骨结构有一定影响。然而，芝麻素对骨质疏松症的作用影响鲜有研究，故而在病理状态下，芝麻素对骨代谢是否有影响尚不得而知。本研究建立OVX大鼠模型，进行大鼠的芝麻素灌胃干预，行Micro-CT并检测OCN含量以及I型胶原表达，以探究芝麻素对骨质疏松症大鼠的骨诱导作用，进一步为应用芝麻素治疗骨质疏松奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 芝麻素制备

芝麻素(S9314，Sigma-Aldrich)使用二甲基亚砜(DMSO，Sigma) 溶解为14.22 mmol/L的溶液，储存于-20 ℃。

1.2 大鼠饲养

Sprague Dawley(SD)大鼠购自内蒙古医科大学第二附属医院医学实验动物中心。雌性SD大鼠18只，10个月龄，体重(72±6) g，维持标准大鼠饮食和自由饮水，饲养于温度(22±2) ℃，湿度(50±5)%，12 h光暗循环的动物室内。所有动物实验均按照国家卫生研究院“实验动物护理原则指南” 进行(NIP出版物85-23, 1996年修订)，并经内蒙古医科大学实验动物伦理委员会批准(项目编号为2017032, 日期为2017年7月15日)。

1.3 去卵巢(ovariectomized, OVX)大鼠模型制备

共18只SD大鼠采用随机数字表法分为3组(每组6只)：OVX组(去卵巢大鼠未干预)、OVX+S(去卵巢大鼠芝麻素干预)组和Sham组(假手术)。OVX组和OVX+S组大鼠进行双侧卵巢切除，建立低雌激素水平的OVX模型。Sham组大鼠卵巢膜脂肪组织暴露后缝合。3组SD大鼠手术条件及手术时间均相同。

1.4 芝麻素灌胃干预

OVX+S组大鼠在上午10:00至上午12:00之间给予芝麻素(80 mg/kg)灌胃，每天1次；OVX组和Sham组大鼠在相同时间给予生理盐水(0.9%)灌胃，每天1次。实验组以及对照组其他条件均相同，大鼠连续喂养12周。

1.5 大鼠股骨Micro-CT测量

连续饲养12周后，所有研究大鼠均用戊巴比妥钠(150 mg/kg)(Sigma)进行安乐死。分离大鼠股骨，并去除周围的软组织。股骨样品在4%多聚甲醛中固定72 h。使用Micro-CT系统(SCANCOCT80; Medical AG)，固定参数设置为55 kV及145 μA，测量参数包括骨密度(bone mineral density, BMD)、骨小梁数量(trabecular number, Tb.N)和小梁间距(trabecular spacing, Tb.Sp)，可视化定量分析股骨三维微结构。

1.6 大鼠股骨OCN的免疫组织化学(IHC)检测

大鼠股骨标本由2名病理科医师共同切片。将切片的股骨样本于70 ℃下干燥30 min。脱蜡和逐级乙醇水合后，将切片EDTA孵育30 min，后于37 ℃下经3% H2O2孵育30 min。给予山羊血清于37 ℃封闭30 min，后与兔抗鼠骨钙素(OCN)抗体(1∶100，ab13420，Abcam)于4 ℃的湿盒中孵育过夜。添加山羊抗兔IgG H&L(HRP)(1∶1 000，ab6721，Abcam)于37 ℃孵育30 min。室温条件DAB(碧云天)染色及苏木精-伊红(H&E)(碧云天)染色，显微镜下观察样本颜色变化，及时终止。逐级脱水后，中性树脂密封切片。Image-Pro Plus 6.0分析阳性OCN的OD值。

1.7 大鼠股骨I型胶原的免疫荧光(ICC/IF)检测

大鼠股骨标本由2名病理科医师协商切片。将切片的股骨样本于70 ℃下干燥30 min。脱蜡和逐级乙醇水合后，将切片EDTA孵育30 min，后于37 ℃下经3% H2O2孵育30 min。给予山羊血清于37 ℃封闭30 min，使用兔抗鼠Ⅰ型胶原(1∶500，ab34710，Abcam)抗体于25 ℃孵育1 h。加入Fluor®488山羊抗兔抗体(1∶500，ZSGB)室温(25 ℃)避光孵育1 h。后经DAPI核染，激光共聚焦显微镜观察切片。结果经Image-Pro Plus软件进行分析。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 芝麻素处理大鼠后对各组股骨Micro-CT结果的影响

芝麻素对预防和治疗骨质疏松症有积极作用，在图1中，Micro-CT显示OVX组BMD(F=34.84,P=0.000 3)及Tb.N(F=13.12，P=0.003 7)低于sham组，而Tb.Sp(F=64.16，P<0.000 1)高于Sham组，表明骨质疏松大鼠的建模成功。与OVX组相比，OVX+S组大鼠BMD (T2=6.737，P<0.05)增加，Tb.Sp(T2=7.124，P<0.05)降低，Tb.N差异无统计学意义。OVX+S组和Sham组的BMD和Tb.N差异无统计学意义，但Tb.Sp差异具有统计学意义(T3=3.769，P<0.05)。

2.2 芝麻素处理大鼠后各组股骨中OCN的免疫组化表达

图2显示OVX组(t=5.083，P<0.0 5)和OVX+S组(t=3.995，P<0.05)的OCN明显低于Sham组。OVX+S组OCN高于OVX组，组间差异无统计学意义。

2.3 芝麻素处理大鼠后各组股骨中I型胶原的免疫荧光表达

图3显示OVX组I型胶原低于Sham组(t=10.40，P<0.05)。OVX+S组和Sham组I型胶原水平相近，组间差异无统计学意义。

3 讨论

本研究中，Micro-CT证实了成功建立的OVX大鼠模型，该模型具有较低的BMD和Tb.N，且具有较高的Tb.Sp，与临床表征相符。给予80 mg/kg芝麻素灌胃可提高去势大鼠股骨BMD和Tb.N，降低Tb.Sp，对去势的骨质疏松症模型的骨量丢失有抑制作用。同时IHC及ICC/IF可知芝麻素对OCN和I型胶原的丢失具有预防作用并可促进OCN和I型胶原的产生。以上结果表明芝麻素(80 mg/kg)对骨骼结构具有保护作用。

所有人在老年阶段都会经历骨密度下降[11]。围绝经期妇女在早期存在更快速度的骨量丢失，导致更高的骨折风险[12]。性腺功能减退是导致男性骨密度下降的重要危险因素[13]。一些生物标志物已被证实在骨质疏松的发展中具有重要检测意义。BMD、Tb.N以及Tb.Sp已被证实与骨质疏松密切相关，与健康人相比，骨质疏松患者的BMD和Tb.N通常较低而同时Tb.Sp较高。此外，OCN以及I型胶原为骨质主要成分，其降低在骨质疏松症的相关检测指标中最具代表性[14]。

前期研究[15]已经证明芝麻素可以通过激活p38和ERK/MAPK途径以及Wnt/b-catenin信号通路诱导成骨分化。本研究中，芝麻素处理提高了BMD、Tb.N、OCN以及I型胶原水平，而下调了Tb.Sp水平，表明芝麻素在大鼠机体复杂结构环境中亦具有促进成骨的能力，其对本实验条件下大鼠的骨量丢失具有保护作用，对骨质疏松具有治疗和预防作用。以芝麻素为切入靶点的基于人体的相关研究厄待开展。

综上，本研究初步证实芝麻素对大鼠骨质疏松症有一定的治疗和预防作用，为进一步探究芝麻素对人骨质疏松症的临床治疗作用奠定理论基础。

注：与Sham组比较，*P<0.05；与OVX组相比，#P<0.05。图3 芝麻素处理大鼠后各组股骨中I型胶原的免疫荧光表达Fig.3 Immunofluorescence expression of type I collagen in the femurs after administration of different dose of sesamin in rats