类风湿关节炎与骨质疏松症的生物信息学分析

蔡鑫 唐芳 马武开 蒋总 金泽旭 樊梅

1.贵州中医药大学，贵州 贵阳 550002

2.贵州中医药大学第二附属医院，贵州 贵阳 550003

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性全身性自身免疫性疾病，其病理特征是滑膜的对称性炎症，尤其在手、足小关节部位。慢性滑膜炎症引起RA患者关节压痛和关节损伤，导致功能障碍、生活质量下降和预期寿命缩短[1]。RA临床表现不局限于关节炎症，大约40%的RA患者存在类风湿结节、血管炎、肺纤维化、心包炎等关节外表现[2]。RA的另一个重要特征是局部骨质丢失，也称为关节周围骨质减少，研究发现关节周围骨量丢失是炎症细胞因子如白细胞介素-6(IL-6)或肿瘤坏死因子(TNF)对关节周围持续影响的结果，更常见于抗瓜氨酸蛋白抗体(ACPA)阳性的RA患者[3-4]。在RA临床发作前数年，ACPA就已经存在，因此部分患者局部骨量丢失在RA的临床前阶段就已经出现[5]。

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种肌肉骨骼疾病，其特征是骨骼强度受损，导致骨折风险增加。RA患者脊柱和髋部的平均骨密度值降低，随着疾病进展而继发OP，同时由于长期接受糖皮质激素治疗，疗程超过6个月的RA患者中近30%将发展为OP[6]。与OP相关的脆性骨折，无论是椎体还是非椎体，都是RA患者的一种严重并发症，与年龄和性别匹配的对照组相比，RA髋部和椎体骨折的发生率更高，并且随着病程、活动减少和频繁使用糖皮质激素而增加[7-8]。

RA与OP的关系尚不完全清楚，本研究通过检索获得RA与OP的共同基因，构建疾病共同基因的蛋白互作(PPI)网络并筛选出关键靶点基因，对关键基因进行GO和KEGG富集分析，为阐述RA与OP的共同发病机制及今后治疗药物的研发提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 疾病靶点获取

在GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)、OMIM数据库(https://omim.org/)、TTD数据库(http://db.idrblab.net/ttd/)、DRUGBANK数据库(https://go.drugbank.com/)、CTD数据库(https://ctdbase.org/)和DisGeNET数据库(https://www.disgenet.org/)中以“rheumatoid arthritis”和“osteoporosis”为关键词分别进行检索，获得RA及OP的疾病基因。利用Venny2.1软件对RA和OP疾病基因进行去重和取交集，得到RA与OP的共同靶点基因。

1.2 PPI网络分析与关键靶基因筛选

将获得的RA与OP共同靶点基因导入STRING在线数据库(https://string-db.org/cgi/)构建PPI网络，物种设置为“Homo sapiens”，使用Cytoscap3.7.2软件绘制PPI可视化网络图，借助R软件筛选出PPI网络中的关键靶点基因。

1.3 基因富集分析

借助DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)对RA与OP的共同靶点基因进行GO功能和KEGG通路富集分析，并绘制富集结果气泡图，利用Cytoscape3.7.2软件绘制疾病基因-信号通路相互作用关系图。

2 结果

2.1 RA与OP基因收集结果

通过检索相关数据库获得RA相关基因5 388个、OP相关基因4 587个，通过取交集后获得1 899个RA与OP共同靶点基因。见图1。

2.2 PPI网络及关键靶点基因

通过STRING数据库构建RA与OP共同靶点基因的PPI网络，该网络图中包括1 773个节点和69 267条边(有126个基因未产生相互作用)。见图2。为确定RA与OP的关键靶点基因，利用R软件筛选出PPI网络中度值(Degree)前30位的节点，包括IL-6、TNF、胰岛素(INS)、AKT丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)、p53肿瘤蛋白(TP53)、血管内皮生长因子A(VEGFA)及表皮生长因子受体(EGFR)等。见图3。

2.3 GO和KEGG富集分析

将RA与OP共同靶点基因导入DAVID数据库进行GO功能和KEGG通路富集分析。GO功能主要富集在受体配体活性(receptor ligand activity)、细胞因子受体结合(cytokine receptor binding)、细胞因子活性(cytokine activity)、肽结合(peptide binding)、囊泡(vesicle lumen)、T细胞活化(T cell activation)、肽分泌的调节(regulation of peptide secretion)及调节造血功能(regulation of hemopoiesis)等方面。见图4。KEGG通路包括PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、JAK-STAT信号通路(JAK-STAT signaling pathway)、破骨细胞分化(osteoclast differentiation)、细胞凋亡(apoptosis)、Th17细胞分化(Th17 cell differentiation)、HIF-1信号通路(HIF-1 signaling pathway)及Wnt信号通路(Wnt signaling pathway)等信号通路。见图5。运用Cytoscape3.7.2软件绘制RA与OP共同靶基因-信号通路相互作用图，图中红色节点表示疾病基因、绿色节点表示富集的KEGG信号通路，节点间连线数量表示相互作用频率，节点越大，富集的疾病靶点基因越多。见图6。

3 讨论

RA是一种自身免疫介导的慢性炎症性关节疾病，活化的滑膜细胞和滑膜巨噬细胞产生多种炎症介质引起关节破坏[9]。OP是RA的常见并发症，骨质疏松性骨折进一步加重了RA患者精神、心理负担，对生活质量造成严重影响，目前发现炎症因子在RA继发OP的病理机制中具有重要作用[10-11]。本研究应用生物信息学方法对RA与OP的共同疾病基因进行分析，筛选出两者的共同关键靶点基因和主要涉及的信号通路，为阐明RA与OP之间的联系及今后研究提供参考。

通过构建RA与OP共同靶基因的PPI网络，筛选出IL-6、TNF、INS、AKT1、TP53、VEGFA、EGFR等关键蛋白。IL-6、TNF等促炎细胞因子在RA患者血清和关节滑液中表达明显升高，对炎症引起的骨质流失起着关键作用，能够刺激成纤维样滑膜细胞和成骨细胞分泌核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)来诱导破骨细胞成熟和活化，从而促进骨吸收并抑制成骨细胞功能。应用IL-6抑制剂能增加RA患者股骨骨密度[12]，对伴有骨量降低的活动性RA患者进行抗TNF-α治疗，可以有效阻止腰椎和髋部骨密度继续下降[13]。INS通过与成骨细胞表面的功能性胰岛素受体结合，促进其增殖、分化，当体内INS缺乏或发生胰岛素抵抗时，成骨细胞的成骨能力明显下降[14]。AKT1与RA成纤维样滑膜细胞凋亡有关[15]，敲减该基因可导致小鼠骨化能力下降[16]。TP53(又称P53)基因突变引起RA滑膜细胞异常增殖，加重疾病进展[17]。P53在OP患者血清中表达上调，抑制P53能够部分逆转骨密度降低[18]。VEGFA是血管发育形成的关键因素，使用VEGFA拮抗剂可阻断RA新生血管形成并抑制营养物质向炎症部位传输[19]。与RA不同的是，VEGFA能增强骨血管生成，促进体外成骨细胞的存活、分化及矿化[20]，具有积极作用。EGFR可促进RA滑膜血管新生，EGFR抑制剂能够减轻小鼠自身免疫性关节炎，减少滑膜和血管翳的形成[21]。而EGFR对于骨祖细胞的维持和新骨形成至关重要，敲减EGFR基因或应用EGFR特异性抑制剂会引起骨质丢失[22]。

通过对RA与OP共同靶基因进行GO和KEGG分析发现，GO功能主要富集在在受体配体活性、细胞因子受体结合、细胞因子活性、T细胞活化、肽分泌的调节等方面。KEGG富集结果表明，PI3K-Akt信号通路、JAK-STAT信号通路、破骨细胞分化、HIF-1信号通路及Wnt信号通路等可能是RA与OP病理机制中的共同信号通路。IL-17通过诱导IL-6、TNF-α等促炎因子参与RA滑膜炎症，PI3K-Akt通路激活可上调IL-17表达，使用该信号通路抑制剂渥曼青霉素能部分或完全阻断IL-17产生[23]。RA滑膜细胞中PI3K表达增加，可活化PI3K-Akt通路而抑制滑膜细胞凋亡[24]。对于OP来说，PI3K-Akt是骨形成中的关键调节途径，LY294002(PI3K抑制剂)降低了MC3T3-E1细胞的成骨能力[25]。JAK-STAT信号通路由JAK酪氨酸蛋白激酶家族(包括JAK1、JAK2、JAK3等)和转录因子STAT家族(包括STAT1、STAT2、STAT3、STAT4等)构成，下调STAT3有助于抑制滑膜细胞存活，该信号通路抑制剂在RA患者中已被证实有效[26]。在OP中IL-6通过调控JAK2/STAT3信号通路影响骨密度及骨小梁生成，阻断该通路后OP模型大鼠骨密度得到明显提升[27]。破骨细胞异常活化是引起RA骨质破坏的关键因素，RA患者的破骨细胞分化和骨吸收能力明显增强[28]。成骨细胞骨形成和破骨细胞骨吸收之间保持动态平衡能够维持骨骼的强度，当骨吸收增强时可导致OP[29]。关节缺氧被认为是RA的重要微环境特征，HIF-1在RA滑膜中大量表达，HIF-1阳性细胞的数量与RA滑膜组织中血管的数量密切相关，抑制HIF-1表达可诱导RA成纤维样滑膜细胞凋亡[30-31]。缺氧可抑制大鼠成骨细胞的骨形成能力及分化，HIF-1过表达能抑制成骨分化和C3H10T1/2细胞中骨钙素的表达[32]。TNF-α可诱导RA滑膜细胞中DKK1的表达，DKK1通过抑制经典Wnt信号通路参与RA骨吸收过程[33]。激活破骨细胞前体中的Wnt通路可以抑制破骨细胞分化，Wnt6、Wnt10a和Wnt10b等能够抑制间充质干细胞向脂肪细胞分化和促进其向成骨细胞分化[34]。

本研究所得RA与OP的关键靶点及信号通路中，IL-6、TNF及JAK-STAT通路抑制剂已在临床中用于治疗RA患者，并取得了良好疗效。IL-6、TNF等炎性细胞因子介导的破骨细胞分化增强引起的骨代谢失衡，在RA与OP骨质流失中具有一致性。尽管经典Wnt通路对于调节RA与OP骨代谢具有相同意义，但关于拮抗该信号途径对RA患者骨质破坏方面的获益尚缺乏研究。HIF-1信号通路的激活不仅引起RA滑膜细胞病理性增殖，也抑制了成骨细胞的骨形成能力，针对该调节通路的研究可能作为治疗RA与OP的重要靶点。VEGFA与EGFR在RA与OP中的作用并不一致，其过表达加重了RA滑膜炎症和血管翳生成，而上调其表达又是促进成骨细胞生成的关键，对于VEGFA和EGFR一方面加重RA病理改变、另一方面RA患者却出现骨质丢失这一矛盾值得进行深入研究。

本研究初步探讨了RA与OP之间存在的相同致病基因和相关的信号调节途径，为探索RA与OP的治疗靶点提供了一定理论参考。由于未对上述疾病靶点基因和信号通路进行验证，本文亦存在一定局限性，需今后进一步研究以明确其具体机制。